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貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
AS6321198 | ATP檸檬酸裂解酶(ACL)測(cè)試盒 | 100管/96樣 |
AS6321198 | ATP檸檬酸裂解酶(ACL)測(cè)試盒 | 50管/48樣 |
測(cè)定意義:
ACL(EC4.1.3.8)是脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶,其催化產(chǎn)生的乙酰輔酶可用于脂肪酸合成和碳鏈延長(zhǎng)、黃酮類物質(zhì)合成、氨基酸合成等。
測(cè)定原理:
ACL在ATP和輔酶存在的情況下催化檸檬酸裂解為乙酰輔酶、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸鹽。蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+,在340nm測(cè)定NADH減少速率,計(jì)算ACL活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體2μL×1支,4℃保存;
樣本的前處理:
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
樣本測(cè)定
(1)工作液的配置,將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中,充分混合溶解,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;(注意:可取少量試劑一至試劑二和試劑三中,充分混勻溶解后轉(zhuǎn)移至試劑一瓶中,重復(fù)2-3遍);用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和 2min20s后的吸光值A(chǔ)2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
ACL活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)ACL活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ACL活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)ACL活力計(jì)算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ACL活力計(jì)算
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每1萬個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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