隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物藥物的品種與適應(yīng)癥方面不斷優(yōu)化?？贵w藥憑借其藥理活性高、特異性強(qiáng)、治療效果好的特點(diǎn)，在全球醫(yī)藥市場(chǎng)大放異彩。2021年FDA批準(zhǔn)的8款抗體新藥中，4款為抗腫瘤藥物，2款為自免藥物，1款為阿爾茲海默癥藥物，1款為降血脂藥物。從藥物形式上看，包含5款單抗，2款A(yù)DC和1款雙抗。
隨著國(guó)內(nèi)抗體藥的發(fā)展，抗體的靶點(diǎn)已由單一靶向轉(zhuǎn)向了多位靶向，抗體開(kāi)發(fā)趨勢(shì)也呈現(xiàn)多樣化，開(kāi)始更多轉(zhuǎn)向利用雙特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物和抗體工程等技術(shù)開(kāi)展，并且抗體純化工藝已相對(duì)成熟。
抗體生產(chǎn)工藝經(jīng)典流程圖
* 除了低pH孵育和除病毒過(guò)濾外，通常會(huì)選擇1~2種層析步驟，作為病毒去除的關(guān)鍵步驟。
1. 深層過(guò)濾
目前深層過(guò)濾開(kāi)始普遍應(yīng)用在澄清工藝步驟。深層過(guò)濾指的是利用多孔介質(zhì)從流動(dòng)相中截留固體顆粒而不是表面截留，且一般介質(zhì)表面都帶有正電荷，可以通過(guò)靜電吸附的方式來(lái)攔截雜質(zhì)顆粒。深層過(guò)濾介質(zhì)一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過(guò)濾介質(zhì)(如硅藻土)和粘合劑 (用于制作平整的界面)組成。所以深層過(guò)濾用于細(xì)胞發(fā)酵液的澄清后便可獲得濁度較好的料液。由于深層過(guò)濾介質(zhì)的孔徑并不均一，所以在深層過(guò)濾之后會(huì)緊接一個(gè)0.45μm或者0.2μm濾器的2級(jí)過(guò)濾工藝，以利于后續(xù)的層析純化。工藝時(shí)間短，效率高，也有去除更多的雜質(zhì)等優(yōu)勢(shì)。目前工藝常用的深層過(guò)濾器pall, millipore, 3M的比較多，開(kāi)發(fā)工藝也比較成熟。開(kāi)發(fā)參數(shù)主要看Vmax(最大體積),Tmax(最高濁度)和Pmax(最大壓力)。
2. 蛋白A層析
此步驟工藝目的是把單抗從培養(yǎng)液中快速的捕獲出來(lái)的最關(guān)鍵步驟。因此步驟可以去除大量的HCP，病毒及HCD和培養(yǎng)基組分物質(zhì)。百林科MaXtar ARPA填料的結(jié)合載量可達(dá)60mg/ml以上。
圖1. MaXtar ARPA層析圖譜
結(jié)果：MaXtar ARPA填料純化抗體樣品純度達(dá)到96.5%，回收率達(dá)到99%。
3. 低pH滅活
細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物有潛在的病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)，因此要求純化工藝中有至少3種不同原理的病毒清除步驟。通常采用的步驟包括：層析步驟、低pH孵育、納濾等。低pH孵育，即將料液pH值調(diào)節(jié)至約3.4-3.7，維持至少1-2h(維持時(shí)間可以根據(jù)目的蛋白的穩(wěn)定性來(lái)確定)，以實(shí)現(xiàn)病毒滅活的目的。有些蛋白在低pH不穩(wěn)定產(chǎn)生聚集，可以考慮加入去污劑，如TNBP/Tween 80等。
4. 陽(yáng)離子層析
陽(yáng)離子交換層析在純化工藝中起著非常重要的作用，可以達(dá)到很好的去除雜質(zhì)效果，尤其是HCP和聚集體去除效果比較明顯。對(duì)陽(yáng)離子交換層析來(lái)說(shuō)，上樣洗脫條件的開(kāi)發(fā)、填料的篩選對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量來(lái)說(shuō)特別重要。對(duì)有些特殊單抗或者雙抗在陽(yáng)離子交換層析過(guò)程中不僅收率低，純度也提不上去，這種情況推薦用疏水填料或者復(fù)合模式填料(MaXtar MMA,MaXtar MMC)來(lái)開(kāi)發(fā)。
5. 陰離子層析
由于大部分單抗PI值大于7，在中性pH上樣條件下大部分蛋白帶正電荷，因此，在陰離子交換層析介質(zhì)上表現(xiàn)出流穿模式。在這步驟不僅能去除雜質(zhì)蛋白，聚集體，內(nèi)毒素，最重要的是能去除病毒，更進(jìn)一步提高藥物安全性。因大部分病毒在pH>7緩沖條件下帶負(fù)電荷，可以和帶正電荷的季銨基團(tuán)結(jié)合，從而達(dá)到去除病毒的作用。對(duì)雙抗來(lái)說(shuō)，大部分雙抗PI值比單抗低，有的能達(dá)到5左右，這時(shí)候可以用陰離子結(jié)合洗脫模式來(lái)純化。但這時(shí)候要注意洗脫緩沖液里面的氯化鈉濃度不能太高，不然會(huì)將有些雜質(zhì)，病毒，內(nèi)毒素都洗脫下來(lái)，達(dá)不到去除雜質(zhì)效果。也可以考慮用復(fù)合填料，比如MaXtar MMA 或者M(jìn)aXtar MMC。
6. 除病毒過(guò)濾
低pH病毒滅活法主要滅活脂包膜病毒，除病毒過(guò)濾濾膜既可以去除非脂包膜病毒，還可以去除脂包膜病毒。由于除病毒過(guò)濾濾器價(jià)格的昂貴和一次性使用的特性，導(dǎo)致除病毒過(guò)濾占用了整個(gè)生產(chǎn)工藝的很大一部分的成本。因此，優(yōu)化除病毒過(guò)濾濾器的載量顯得格外的重要。在病毒過(guò)濾過(guò)程中，常常發(fā)現(xiàn)由于各種因素可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)濾通量降低，濾器載量降低。從濾器選擇、樣品pH與電導(dǎo)優(yōu)化、樣品濃度選擇和添加劑選擇這四個(gè)方面來(lái)優(yōu)化濾器的載量，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本，節(jié)省過(guò)濾時(shí)間的目的。
7. UF/DF
這步驟目的主要是把樣品濃縮后換液到制劑緩沖液里。在這步驟要關(guān)注目的蛋白在高濃度下的穩(wěn)定性和合適的壓力。
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參考文獻(xiàn)
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(4)醫(yī)藥筆記：2021年FDA批準(zhǔn)的8款抗體新藥
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