親和層析填料是一種利用固定相的結(jié)合特性來(lái)分離分子的色譜方法。親和色譜在凝膠過(guò)濾色譜柱上連接與待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，并且這種結(jié)合是可逆的，在改變流動(dòng)相條件時(shí)二者還能相互分離。親和色譜可以用來(lái)從混合物中純化或濃縮某一分子，也可以用來(lái)去除或減少混合物中某一分子的含量。
親和色譜具有高選擇性，而且能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)還具有對(duì)活性樣品高回收率的特點(diǎn)，所以親和色譜可以用來(lái)從細(xì)胞提取物中分離純化核酸、蛋白質(zhì)，還可以從血漿中分離抗體。分離重組蛋白就經(jīng)常使用親和色譜。
親和層析填料的純化介質(zhì)及其作用原理：
1.Ni柱純化
Ni柱中的鎳可以與有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的堿性蛋白結(jié)合
Ni-純化介質(zhì)是Ni離子金屬螯合介質(zhì)，Ni柱中的螯合的Ni可以與咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合
Ni親和層析柱可分為——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni-IDA螯合了三價(jià)，Ni-NTA螯合了四價(jià)，所以IDA的載量要NTA比的高。IDA與蛋白結(jié)合能力較弱，載量相對(duì)較高，穩(wěn)定性較差，Ni易脫落。而NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，特異性較高。
2.GST親和層析介質(zhì)（GSTAgarose）
是用于純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白，其谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶與谷胱甘肽有親和作用蛋白的分離介質(zhì)，一步分離就可得到高純度的GST融合目標(biāo)蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。
3.麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)
有42.5KD大小，不含Cys，作為融合蛋白的標(biāo)簽，通常放在N端在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。MBP能促進(jìn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，尤其對(duì)于難表達(dá)的真核細(xì)胞蛋白，膜蛋白病毒蛋白有很好的促溶表達(dá)能力，MBP融合蛋白的純化在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，使用麥芽糖進(jìn)行溫和洗脫。保護(hù)了MBP標(biāo)簽蛋白的活性。標(biāo)簽在純化后期需要用酶切去除，常用的內(nèi)切酶是FactorXa，麥芽糖酶和腸激酶。
4.ProteinA親和層析介質(zhì)
常用于純化和分離IgG。ProteinA是一種分離自金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，主要通過(guò)Fc片段結(jié)合哺乳動(dòng)物IgG。天然ProteinA有5個(gè)IgG結(jié)合域和許多其它的未知功能域。重組ProteinA包含5個(gè)高IgG結(jié)合域，并去除了其它非主要結(jié)合域以降低非特異性結(jié)合。
ProteinA親和層析介質(zhì)已經(jīng)廣泛用于從生物流體或細(xì)胞培液中分離純化各種類型的IgG或者IgG片段。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，ProteinA和IgG的相互作用僅涉及Fc區(qū)域，而不影響Fab片段和抗原的結(jié)合
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