FDA的William Hallett博士曾在2016年的CHI年度會議上專題報告講述了蛋白聚集體對免疫原性的影響1。報告中提到：在生產(chǎn)過程、產(chǎn)品運輸、儲存和交付過程中，均可能導(dǎo)致蛋白聚體的形成。由于聚集體可能引起免疫原性，因此聚集體的含量控制是關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。
隨著抗體藥的發(fā)展突飛猛進，抗體的靶點由單一靶向轉(zhuǎn)向多位靶向，抗體開發(fā)趨勢也呈現(xiàn)多樣化，更多轉(zhuǎn)向利用雙特異性抗體、抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)等技術(shù)做創(chuàng)新藥的開發(fā)；多元化的新藥開發(fā)也為下游純化工藝帶來更多的挑戰(zhàn)。針對聚集體等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的去除成為必須克服的工藝難點。本文將針對使用不同層析原理去除聚集體的策略進行分享：
蛋白A親和層析MaXtar ARPA：
添加劑助力聚集體去除
蛋白A親和層析被廣泛用于抗體純化的捕獲步驟。由于蛋白A通過Fc區(qū)特異性結(jié)合抗體，這一步可以顯著減少過程相關(guān)雜質(zhì)，包括宿主細胞蛋白和核酸。然而，在典型條件下，蛋白A色譜法去除聚集體的效果較差，已知聚集體比單體結(jié)合更強，單獨調(diào)節(jié)洗脫pH通常不足以實現(xiàn)良好的分離。因此，在許多情況下，聚集體的去除往往依靠后續(xù)離子交換層析或多模式層析，案例分別介紹：洗滌和洗脫緩沖液中加入氯化鈣/聚乙二醇(PEG)或氯化鈉/聚乙二醇(PEG)組合，可以顯著提高蛋白質(zhì)A的聚集體去除能力，鹽和PEG的協(xié)同作用促進單體與聚集體有效分離。
樣品信息：澄清后培養(yǎng)液
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, 150 mM NaCl, pH 7.4
洗滌Buffer: 50 mM NaAc-HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 5.5;
Or 50 mM NaAc-HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 5.5
洗脫Buffer: 50 mM HAc, 500 mM CaCl2, 5% PEG, pH 3.1; Or 50 mM HAc, 750 mM NaCl, 5% PEG, pH 3.1
圖1： 添加500mM CaCl2和5%PEG的蛋白A純化圖譜
圖2： 未優(yōu)化和優(yōu)化方案下蛋白A層析疊加圖
小結(jié)
圖1和圖22可見，洗滌和洗脫緩沖液中加入500mM CaCl2和5%PEG，或者750 mM氯化鈉和5% PEG顯著提高單體-聚集體的分離，SEC純度有明顯提高。
多模式陰離子MaXtar MMA:
通過流穿模式去除聚集體
MaXtar MMA 是一款強陰離子的多模式填料，配基通過多種作用與目標(biāo)分子結(jié)合，如離子作用、疏水作用和氫鍵作用。MMA經(jīng)常用于抗體純化中的精純階段，可以去除聚集體、蛋白A配基、HCP、DNA 和病毒等多種雜質(zhì)。
樣品信息：雙抗ProteinA洗脫液，聚集體含量11%
平衡Buffer: 50 mM Tris-HAc, pH 7.5
上樣：Protein A洗脫液(pH調(diào)節(jié)到7.5)(載量80 mg/ml)
淋洗Buffer: 50mM Tris-HCl, pH7.5
圖3： MaXtar MMA層析圖譜
小結(jié)
SEC結(jié)果表明，雙抗的聚集體含量由 11% 下降到至 1.6%。
多模式陽離子MaXtar MMC HR:
通過結(jié)合模式去除聚集體
MaXtar MMC HR是一款多模式弱陽離子填料，用于抗體的精細純化，可以達到去除聚集體、降解片段等多種雜質(zhì)。
圖43：多模式層析圖譜
圖53：SEC檢測圖譜
小結(jié)
SEC 結(jié)果顯示，雙抗的聚集體含量由 9.6% 下降到了 1.2%。電泳圖顯示，除聚集體外，輕鏈缺失的降解片段同樣具有很好的去除效果。
疏水層析:去除聚集體
聚集體的疏水性比單體要強，選擇高分辨率的MaXtar Phenyl HR，可以高效去除聚集體。
圖64：未優(yōu)化和優(yōu)化方案下的高分辨率的Phenyl洗脫圖譜
小結(jié)
圖6可見Phenyl洗脫純度都可以達到98%以上，同時可以通過添加己二醇/精氨酸的方式提高收率。對于自身疏水性比較強的雙抗分子，建議可以選擇疏水性較弱的填料(MaXtar Octyl/Butyl)，使目的雙抗流穿，聚體結(jié)合。
參考文獻
1、Impact of Aggregates on Immunogenicity of Protein Therapeutics: A Regulatory Perspective
2、Yuan Zhang, Ying Wang, Yifeng Li,A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability. Protein Expression and Purification 158(2019)65-73
3、Yan Wan,Ting Zhang, Yumeng Wang, Ying Wang, Yifeng Li,Removing light chain-missing byproducts and aggregates by Capto MMC ImpRes mixed-mode chromatography during the purification of two WuXiBody-based bispecific antibodies . Protein Expression and Purification 175 (2020) 105712
4、Troii H., et al., Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from phenyl based hydrophobic interaction chromatography resins. Journal of Chromatography B 1096(2018):20-30
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