什么是膠原蛋白？
What is collagen?
膠原蛋白是一類生物高分子蛋白的總稱，它是動物結(jié)締組織的主要成分之一，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占總蛋白質(zhì)含量的25%～30%。膠原蛋白因其機械性能、止血性能、促細(xì)胞生長、弱抗原性、生物降解性、膠原自締 合性和其他重要的生物學(xué)特性而被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，另外膠原蛋白是膠原的水解產(chǎn)物，存在大量的甘氨酸、羥脯氨酸和羥基賴氨酸，這些氨基酸被譽為天然保濕因子，也被廣泛用于化妝品工業(yè)。[1]
中國膠原蛋白市場快速發(fā)展，市場規(guī)模穩(wěn)步提升。隨著膠原蛋白制備技術(shù)的成熟，量產(chǎn)成為可能，成本有較大的下降空間，膠原蛋白產(chǎn)品的性價比得到提升，終端產(chǎn)品市場規(guī)模有望保持增長。2021年中國膠原蛋白市場規(guī)模為287億元，預(yù)計未來五年保持較高的增長率，在2027膠原蛋白市場規(guī)?？蛇_1738億元。
膠原蛋白種類較多，常見類型為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)。Ⅰ型膠原粗大堅實，用于支撐皮膚硬度，使皮膚堅固；Ⅲ型膠原細(xì)小且具有良好的彈性，對皮膚的彈性、疤痕愈合有重要作用，其減少會導(dǎo)致皮膚衰老。
膠原蛋白可分為重組膠原蛋白和動物源膠原蛋白,目前市場上主流的膠原蛋白提取制備方法有兩種：基因重組法和動物源提取法。
動物源性膠原蛋白從動物組織中提取，其原料是牛腱，豬皮等動物組織，無水溶性且存在病毒傳染風(fēng)險和排異反應(yīng)。動物源提取法是指通過酸法、堿法、酶法等方式從動物肌腱、皮膚等組織中來提取膠原蛋白。
動物源提取法的過程可大致分為處理、溶出和純化 3 個步驟。
1.處理：動物組織的去脂、切片、清洗、消毒和粉碎等；
2.溶出：添加蛋白酶、酸性介質(zhì)進行反應(yīng)；
3.純化：鹽析、透析純化等工藝，在純化工藝上結(jié)合膠原蛋白的性質(zhì)填料選擇則以陽離子為主，比如SP Chromastar FF等。
膠原蛋白的主要制備流程圖
其中基因重組法根據(jù)不同的技術(shù)路徑，膠原蛋白主要分為三類：
01 重組人膠原蛋白：由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長氨基酸序列，且有三螺旋結(jié)構(gòu)。
02 重組人源化膠原蛋白：含人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。
03 重組類膠原蛋白：經(jīng)設(shè)計、修飾后的特定基因編碼的氨基酸序列或其片段，或是這 類功能性氨基酸序列片段的組合。其基因編碼序列或氨基酸序列與人膠原蛋白的基 因編碼序列或氨基酸序列同源性低。
根據(jù)重組膠原蛋白研究策略，目前可分為3類[2]：
目前，多種重組表達系統(tǒng)被應(yīng)用于膠原蛋白的重組表達，如大腸桿菌、酵母、動物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動物和轉(zhuǎn)基因植物等，如表1[3]所示。重組類人膠原蛋白是利用DNA重組技術(shù)，通過重組表達得到類似人源特性的膠原蛋白重組膠原蛋白。大腸桿菌表達和酵母表達則是常用的兩種表達方式。通過大腸桿菌和酵母表達均可獲得羥化的重組膠原蛋白，大腸桿菌表達產(chǎn)率低、價格高。酵母表達的產(chǎn)率隨著表達技術(shù)的發(fā)展有所提升，逐漸成為重組膠原蛋白工業(yè)化的趨勢。
而分離純化工藝復(fù)雜是限制重組膠原蛋白工業(yè)化發(fā)展的主要原因之一。目前重組膠原蛋白的分離純化方式有親和層析法、鹽析沉淀法、離子交換層析法、凝膠層析法等，純化產(chǎn)率在68.6%～80.5%，純化費用占總生產(chǎn)成本的20%～30%。下面讓我們對不同來源的純化工藝一探究竟吧：
實驗案例1：
天然膠原蛋白純化-MaXtar S
MaXtar S是一款強陽離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對其進行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如:重組蛋白、抗體、核酸、病毒及類病毒顆粒、多糖等。相比于傳統(tǒng)的強陽離子交換層析介質(zhì)，MaXtar S表現(xiàn)出更優(yōu)的性能:
(1)改良的MaXtar基架具有更強剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。
(2)通過升級配基偶聯(lián)方式，提高層析介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合載量。
樣品信息：牛皮提取液
平衡Buffer：20 mM HAc-NaAc, pH 4.6
洗脫Buffer：20 mM HAc-NaAc, 300 mM NaCl, pH 4.6
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| MaXtar S層析圖譜 | 洗脫液 HPLC圖譜 |
層析后蛋白的回收率可達到88.7%并且在HPLC測純度上基本為膠原蛋白三組分。
實驗案例2：
重組膠原蛋白純化
2.1 親和層析(粗純)
Ni Chromstar Excel是一款親和層析介質(zhì)，將過渡金屬離子Ni2+預(yù)先螯合在Chromstar基架上制成。該層析介質(zhì)利用 Ni2+與蛋白質(zhì)上某些氨基酸(主要是組氨酸)的側(cè)鏈之間的相互作用，實現(xiàn)含有與不含有這些氨基酸、含有這些氨基酸數(shù)量多與少的蛋白質(zhì)的分離純化。
樣品信息：大腸桿菌表達(His標(biāo)簽)破碎澄清液
平衡Buffer: 20 mM PB, 150 mM NaCl, pH 7.5
洗雜Buffer: 20 mM PB, 150 mM NaCl, 50mM 咪唑, pH 7.5
洗脫Buffer: 20 mM PB, 150 mM NaCl, 500mM 咪唑, pH 7.5
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| Ni Chromstar Excel 柱層析圖譜 | Ni Chromstar Excel 柱層析 SDS-PAGE |
通過Ni親和層析可以去除99%以上雜蛋白并且富集目標(biāo)膠原蛋白實驗?zāi)z原蛋白的粗純。
重組膠原蛋白純化
2.2 離子交換層析/疏水層析(精純)
MaXtar Phenyl HR是一款疏水相互作用層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下疏水性質(zhì)和多少的差異對其進行分離。該系列層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如:重組蛋白、抗體、病毒疫苗等。
樣品信息：Ni親和層析后洗脫液
平衡Buffer: 20 mM PB, 1M (NH4)2SO4, pH 7.5
洗脫Buffer: 20 mM PB, pH 7.5
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| Phenyl層析圖譜 | Phenyl層析 SDS-PAGE |
可以從層析圖譜及檢測圖譜可以看出疏水作用可以有效純化出目標(biāo)蛋白并且純度較高，回收率大于80%。
2.3 MaXtar Q
MaXtar Q 是一款強陰離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對其進行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如：重組蛋白、抗體、核酸、病毒及類病毒顆粒、多糖等。
樣品信息：親和層析后洗脫液
平衡Buffer: 20 mM PB, pH 7.5
洗脫Buffer: 20 mM PB,100 mM NaCl, pH 7.5
洗脫Buffer: 20 mM PB,400 mM NaCl, pH 7.5
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| MaXtar Q 柱層析圖譜 | MaXtar Q 柱層析 SDS-PAGE |
可以從層析圖譜及檢測圖譜可以看出離子交換層析也可以有效純化出目標(biāo)蛋白并且純度較高，回收率大于80%。
綜合而言，
以下款產(chǎn)品則是膠原蛋白項目上的理想選擇，
也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多個項目中做生產(chǎn)放大。
MaXtar S
MaXtar S表現(xiàn)出更優(yōu)的性能:
(1) 改良的MaXtar基架具有更強剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。
(2) 通過升級配基偶聯(lián)方式，提高層析介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合載量。
Ni Chromstar FF
因為其高選擇性以及特異性親和，被作為大部分帶His標(biāo)簽親和的主要選擇。
Ni Chromstar Excel
另外相比Ni Chromstar FF 和Ni Chromstar HP，Ni Chromstar Excel 具有以下優(yōu)勢：
(1) 與 Ni2+有很強的結(jié)合力，能耐受100mM的EDTA，對緩沖液具有更好的兼容性。
(2) 具有更高的耐堿性，可耐受 1M NaOH，無需脫鎳清洗，避免交叉污染，省時高效。
MaXtar Q
MaXtar Q 擁有很好的放大生產(chǎn)性能：
(1) 高度交聯(lián)的瓊脂糖基架，具有優(yōu)異的剛性，因此在低反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)高工藝流速，提高工藝效率。
(2) 通過化學(xué)修飾，具有出色的化學(xué)兼容性，耐受氫氧化鈉等 CIP 清洗。
MaXtar Phenyl HR
MaXtar Phenyl HR擁有很好的放大生產(chǎn)性能:
(1) 高度交聯(lián)的瓊脂糖基架，具有優(yōu)異的剛性，因此在低反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)高工藝流速，提高工藝效率。
(2) 細(xì)粒徑設(shè)計，提高分辨率。
(3) 親水性基架，更大程度降低對配基疏水性作用發(fā)揮的影響。
(4) 通過化學(xué)修飾，具有出色的化學(xué)兼容性，耐受氫氧化鈉等CIP 清洗。
綜上，目前我們在不同種類的膠原蛋白純化上積累了豐富的工藝開發(fā)經(jīng)驗。百林科作為一個整體解決方案供應(yīng)商，在提供層析介質(zhì)的同時，也提供相應(yīng)的層析設(shè)備以及層析柱，超濾系統(tǒng)以及其他相關(guān)產(chǎn)品，也歡迎大家咨詢我們其他產(chǎn)品線。同時我們技術(shù)支持團隊可以協(xié)助大家做工藝開發(fā)與優(yōu)化服務(wù)，以及協(xié)助大家項目轉(zhuǎn)移等橋接服務(wù)。
參考文獻
[1]傅容湛,范代娣,楊婉娟等.重組膠原蛋白的產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景展望[J].生物工程學(xué)報,2022,38(09):3228-3242.DOI:10.13345/j.cjb.220061.
[2]查青青,聶姍姍,于文. 重組膠原蛋白研究進展及其應(yīng)用[J]. 中國洗滌用品工業(yè),2022(8):41-45. DOI:10.3969/j.issn.1672-2701.2022.08.005.
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