目前百林科除了可以提供上游質(zhì)粒發(fā)酵的一次性解決方案,從大腸收獲,裂解,純化等工藝步驟提供系統(tǒng)的解決方案,具體如下圖:
圖1 百林科在質(zhì)粒上的整體解決方案
上游通過(guò)大腸桿菌表達(dá)菌體,通過(guò)菌體收獲,下游的裂解工藝,澄清過(guò)濾、濃縮工藝,層析純化工藝可以獲得高純度的超螺旋DNA(scDNA)。下面從裂解以及澄清和層析等方面做重點(diǎn)的解析:
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裂解工藝策略:大腸桿菌的裂解通常會(huì)采用堿裂解的方法進(jìn)行,操作方法簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)。在大腸桿菌的菌體裂解時(shí)釋放大量的RNA、線性DNA,開(kāi)環(huán)質(zhì)粒(ocDNA)及宿主蛋白(HCP)、宿主核酸(HCD)、內(nèi)毒素等雜質(zhì),這些雜質(zhì)給后續(xù)的超螺旋質(zhì)粒的純化帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。堿裂解工藝可通過(guò)優(yōu)化菌體的懸浮比例,裂解比例,裂解時(shí)長(zhǎng),中和比例和時(shí)間等參數(shù),減少雜質(zhì)的產(chǎn)生,提高裂解效率。百林科可以提供相應(yīng)的Mixer 作為裂解設(shè)備來(lái)滿足GMP生產(chǎn)階段的需求。
圖2:百林科用于質(zhì)粒裂解的設(shè)備
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澄清過(guò)濾:根據(jù)工藝需要一般選用10~50μm的除絮狀沉淀和0.45μm孔徑的濾器進(jìn)行二級(jí)澄清過(guò)濾或0.2μm的中空纖維膜進(jìn)行澄清過(guò)濾,收集的澄清液進(jìn)行TFF濃縮換液。澄清過(guò)濾可通過(guò)優(yōu)化濾器材質(zhì),濾器的膜過(guò)濾載量,膜通量;0.2μm的中空纖維膜可選擇百林科的TFFNOVA®系列的中空纖維柱,目前在大腸的裂解澄清液中能達(dá)到平均30LMH的處理通量。
圖3:百林科中空纖維以及在大腸澄清上的應(yīng)用
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濃縮工藝策略:超濾濃縮可以去除RNA,HCP等其他雜質(zhì),所需上樣體積。濃縮換液以優(yōu)化膜包或者中空纖維的材質(zhì)、孔徑,濃縮倍數(shù),TMP控制,剪切力控制,提高工藝的重復(fù)性和可放大性。
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層析純化工藝開(kāi)發(fā)策略:目前質(zhì)粒層析工藝Chromstar 6FF+MaXtar PlasmidCap HR+MaXtar Q HR三步法最為經(jīng)典常用,針對(duì)不同的質(zhì)粒產(chǎn)品和用戶需求,百林科也有不同的質(zhì)粒產(chǎn)品純化策略,例如可以使用BaronCHT Type II去除HCD和ocDNA,或者使用CaCl2或硫酸銨沉淀樣品后使用MaXtar Q+MaXtar PlasmidCap HR/ BaronCHT Type II兩步層析純化超螺旋質(zhì)粒。
圖4:百林科純化質(zhì)粒的工藝路線
下面我們以經(jīng)典的三步法
做純化工藝的分享
第一步分子篩層析:
根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分子量差異和分子構(gòu)象差異,通過(guò)優(yōu)化上樣體積與濃度,流速,柱高等因素,主要去除HCP,HCD及RNA等雜質(zhì)。
推薦使用: 百林科 Chromstar 6FF
推薦buffer 體系: 2.1 mol/L (NH4)2SO4+50mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA,pH=7.3~7.7
圖5:Chromstar 6FF在質(zhì)粒純化的效果
質(zhì)粒親和層析
根據(jù)利用PlasmidCap配基的嗜硫吸附及親水-疏水混合模式作用,可去除結(jié)合能力較弱的線性DNA,ocDNA,主要通過(guò)上樣載量,保留時(shí)間,上樣與洗脫的pH及電導(dǎo)的優(yōu)化,提高超螺旋DNA比例。
推薦使用:百林科 MaXtar PlasmidCap HR
推薦buffer 體系:
EQ Buffer:1.9 mol/L (NH4)2SO4+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA,pH=7.3~7.7
Elution Buffer:1.7 mol/L (NH4)2SO4+0.3 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA,pH=7.3~7.7
圖6:MaXtar PlasmidCap HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用(去除OcDNA)
陰離子交換層析
依據(jù)不同電荷的分子保留強(qiáng)弱的不同,達(dá)到去除內(nèi)毒的目的。主要通過(guò)上樣載量,保留時(shí)間,洗脫電導(dǎo)和pH的優(yōu)化,高純度,低工藝雜質(zhì)的超螺旋質(zhì)粒。
推薦使用:百林科 MaXtar Q HR
推薦Buffer 體系:
EQ Buffer:0.4 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA,pH=7.3~7.7
Elution Buffer:0.8 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA,pH=7.3~7.7
圖7:MaXtar Q HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用
客戶使用百林科三步層析法純化質(zhì)粒的結(jié)果匯總:
如果遇到一些質(zhì)粒的聚集體等的去除可以嘗試CHT的純化方案。CHT是一種無(wú)機(jī)純相層析介質(zhì),高溫焙燒成球體,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子交換和鈣金屬親和混合分離模式,在去除聚集體和HCD方面具體的優(yōu)勢(shì)。
CHT在超螺質(zhì)粒純化去除HCD及scDNA,優(yōu)化上樣及洗脫條件可獲得更高純度的超螺旋質(zhì)粒。
圖8:BaronCHT Type II在質(zhì)粒純化上的應(yīng)用(7.7 mm×100 mm,4.7mL/CV)
兩步層析純化
菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品,經(jīng)過(guò)CaCl2或硫酸銨沉淀后質(zhì)粒樣品可以,經(jīng)過(guò)離子交換層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒,推薦MaXtar Q HR + MaXtar PlasmidCap HR ,通過(guò)優(yōu)化上樣,洗脫等工藝條件,可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒?;蛘進(jìn)aXtar COLL 700+ MaXtar PlasmidCap HR的方案,其中COLL700是一款復(fù)合層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì),它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成:外殼是多孔的鈍化層 ,確保 700KD 以上的大分子不會(huì)進(jìn)孔,直接走外水流穿;核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和吸附負(fù)電荷作用基團(tuán)的球形內(nèi)核,更大程度結(jié)合宿主蛋白、 核酸等雜質(zhì)。菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品,經(jīng)過(guò)COLL 700復(fù)合層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒,推薦MaXtar COLL 700+MaXtar PlasmidCap HR,通過(guò)優(yōu)化上樣,洗脫等工藝條件,可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒。
目前有較多客戶與百林科在質(zhì)粒上進(jìn)行方案的合作,歡迎大家掃碼聯(lián)系我們當(dāng)?shù)氐匿N售與技術(shù)人員。
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