IgM純化并非易事
IgM 抗體是免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)的一種類(lèi)型，主要存在于體液免疫應(yīng)答的早期階段?？v觀免疫球蛋白的進(jìn)化史，IgM是最古老的抗體類(lèi)型之一。在宿主抵御病原入侵的免疫響應(yīng)過(guò)程中，每種類(lèi)型的抗體都有其獨(dú)特的功能效應(yīng)。IgM最初表達(dá)于B淋巴細(xì)胞表面，參與構(gòu)成B細(xì)胞表面受體 (BCR) 。B細(xì)胞活化后，可由漿細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgM (sIgM) ，參與早期體液免疫應(yīng)答。相較于其他類(lèi)型的免疫球蛋白，IgM具有分子量大、抗原結(jié)合位點(diǎn)多、親和力高等特點(diǎn)，使其在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，由于IgM與其他免疫球蛋白存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致其純化困難。
純化前，你需要知道的事：IgM的特點(diǎn)
01 分子量大
IgM的單體大小在190 kDa左右，重鏈由一個(gè)可變區(qū) (Vμ) 和四個(gè)恒定區(qū) (Cμ1-4) 組成，輕鏈由一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)組成 (Vκ‐Cκ/Vλ‐Cλ) ，在重鏈的C端還有一條18個(gè)氨基酸短肽對(duì)于IgM的多聚化至關(guān)重要，且將該序列整合至其他類(lèi)型的抗體分子也能促使其產(chǎn)生多聚體。IgM通常以五聚體 (pentamer) 或六聚體 (hexamer) 的形式存在，兩者的分子量分別在900 kDa與1,050 kDa左右，其中五聚體是一個(gè)非正五邊形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個(gè)50°左右的缺口由J鏈 (J-chain) 占據(jù)以保持構(gòu)象穩(wěn)定，是 IgG、IgA 和 IgE 的 10 倍左右。
02 抗原結(jié)合位點(diǎn)多
每個(gè) IgM 分子有 10 個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，使其具有較高的親和力和識(shí)別能力，是最有效的抗體。相比于IgG，多聚體結(jié)構(gòu)使IgM能夠多價(jià)結(jié)合抗原并且更加高效穩(wěn)定地結(jié)合補(bǔ)體C1q(圖2)，啟動(dòng)補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒效應(yīng) (CDC) 。同時(shí)，五聚體IgM中的J鏈還能夠與上皮細(xì)胞表面的多聚免疫球蛋白受體 (pIgR) 結(jié)合，進(jìn)而將IgM轉(zhuǎn)運(yùn)至黏膜表面參與黏膜免疫。
03 親和力高
由于 IgM 抗體結(jié)合抗原的位點(diǎn)較多，使得其與抗原的結(jié)合力相對(duì)較高。早期的IgM項(xiàng)目幾乎使用的都是未經(jīng)歷抗體親和力成熟天然抗體，具有較低的親和力與特異性，因此效果大多不盡人意，但這些臨床試驗(yàn)至少證明了IgM的安全性。通過(guò)對(duì)IgM的工程化改造，例如在J鏈處引入CD3抗體或其他配體分子使其發(fā)揮細(xì)胞橋接作用，能夠使IgM的臨床價(jià)值進(jìn)一步提升。
如何獲得高純度IgM抗體?
無(wú)論是應(yīng)用于病原感染的早期診斷還是疾病治療，如何有效獲得高純度IgM抗體是我們必須要解決的問(wèn)題。相較于IgG，IgM的分子量更大、溶解度更低且更易降解，鹽濃度、pH、溫度都會(huì)在很大程度上影響IgM的穩(wěn)定性。因此在遵循CIPP純化策略的基礎(chǔ)上，對(duì)IgM的純化需要有更多考量。 百林科擁有多樣的層析填料，可滿足于不同情況的純化要求。
方法一、親和層析法
IgM的Fc段存在較大的空間位阻，因此通常認(rèn)為Protein A難以用于IgM的親和捕獲，但這并非是絕對(duì)的。Protein A除了能夠結(jié)合抗體Fc段，還可與VH3基因參與編碼的重鏈可變區(qū)序列結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的捕獲。因此，對(duì)于IgM的純化，以百林科 MaXtar® ARPA為代表的高載量、高耐堿Protein A抗體親和填料仍然是個(gè)值得嘗試的選擇。
在Protein A效果不理想的情況下，可以著眼于Fab段的其他結(jié)構(gòu)域進(jìn)行親和填料的選擇。其中MaXtar® Protein L具有廣譜的抗體結(jié)合活性，同樣可應(yīng)用于天然或重組IgM的純化。
考慮到IgM的穩(wěn)定性，Protein A/L低pH的洗脫條件對(duì)于部分IgM可能有些劇烈，這種情況下可以選擇其它類(lèi)型的親和介質(zhì)。由于IgM具有大量的二硫鍵，基于嗜硫親和原理的百林科MaXtar® PlasmidCap HR 親和填料也非常適用于IgM的純化。
除成品的親和填料外，還通過(guò)制備特定的抗原或抗體，將其固定在預(yù)活化填料上，利用IgM抗體與其他免疫球蛋白的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn) IgM抗體的純化。這種方法具有較高的特異性，但操作過(guò)程較為復(fù)雜，需要制備特定的層析柱。
? 百林科 MaXtar® ARPA 抗體親和填料是一款用于抗體純化的親和層析介質(zhì)，通過(guò)抗原與抗體之間特異性相互作用進(jìn)行分離。MaXtar® ARPA 擁有高載量、高流速、耐堿的特性：(1) 高流速、高動(dòng)態(tài)結(jié)合載量縮短了處理時(shí)間。(2) 修飾的耐堿 rProtein A 配基可耐受 0.5M NaOH 進(jìn)行 CIP。
層析填料全家福
方法二、 凝膠過(guò)濾法(含復(fù)合多模式)
鑒于IgM具有分子量大的特點(diǎn)，可以利用IgM與其他蛋白質(zhì)在分子大小上的差異，通過(guò)百林科Chromstar® 6FF 凝膠過(guò)濾填料將IgM從混合物中分離出來(lái)，這種方法操作簡(jiǎn)便，但特異性較低，容易受到大分子雜質(zhì)的干擾。且傳統(tǒng)的凝膠過(guò)濾由于上樣量小、流速低、層析過(guò)程比較耗時(shí)等原因不利于維持IgM的穩(wěn)定。因此，同樣基于尺寸排阻原理開(kāi)發(fā)的百林科 MaXtar® COLL 多模式填料系列同樣適用于將IgM從混合物中分離出來(lái)。
區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，百林科 MaXtar® COLL 多模式填料由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 400/700KD 以上的大分子不會(huì)進(jìn)孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和吸附負(fù)電荷作用基團(tuán)的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物祥本的分離純化。經(jīng)清潔再生后，填料可重復(fù)使用。相較于傳統(tǒng)的凝膠過(guò)濾，采用流穿模式的MaXtar® COLL 700和MaXtar® COLL 400都能夠支持更大的上樣體積和更高的流速，綜合效率提升了100倍，更加適合IgM的純化。
?百林科Chromstar® 6FF 凝膠過(guò)濾填料 是一款高度交聯(lián) (交聯(lián)比為6%) 瓊脂糖基架的凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)，利用不同分子的分子量差異和分子構(gòu)象不同對(duì)其進(jìn)行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如：重組蛋白、抗體、核酸、病毒及類(lèi)病毒顆粒、多糖等類(lèi)型項(xiàng)目。
表：Chromstar® 6FF產(chǎn)品參數(shù)
? 百林科MaXtar® COLL 多模式填料是一款多模式層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 400/700KD 以上的大分子不會(huì)進(jìn)孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和吸附負(fù)電荷作用基團(tuán)的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物樣本的分離純化。
方法三、離子交換層析法
離子交換層析法是利用IgM與其他蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度和pH值上的差異，通過(guò)離子交換樹(shù)脂將 IgM 從混合物中分離出來(lái)。這種方法操作簡(jiǎn)便，能夠有效去除樣品中的HCP、HCD、內(nèi)毒素以及病毒。IgM的等電點(diǎn)分布范圍大致在5.5-7.4之間，根據(jù)不同IgM分子的實(shí)際等電點(diǎn)，可靈活采用流穿模式或結(jié)合洗脫模式。
?百林科MaXtar® Q HR 是一款高分辨率的強(qiáng)陰離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對(duì)其進(jìn)行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如：重組蛋白、抗體、核酸、 病毒及類(lèi)病毒顆粒、多糖等。
?百林科MaXtar® DEAE 是一款弱陰離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對(duì)其進(jìn)行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化。相比于傳統(tǒng)的弱陰離子交換層析介質(zhì)，MaXtar®DEAE 表現(xiàn)出更優(yōu)的性能：(1) 改良的MaXtar® 基架具有更強(qiáng)剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。(2) 通過(guò)升級(jí)配基偶聯(lián)方式，提高層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量
?百林科MaXtar® MMA HR 是一款改良瓊脂糖基架的多模式層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的離子交換層析介質(zhì)，它由多個(gè)不同性質(zhì)的基團(tuán)組成：氨基、氫鍵和疏水基團(tuán)。該層析介質(zhì)可以去除核酸、宿主蛋白、聚集體、病毒 等主要雜質(zhì)，廣泛應(yīng)用于多糖、抗體、病毒載體或疫苗領(lǐng)域。相比于傳統(tǒng)的單一模式層析介質(zhì)，MaXtar® MMA HR 表現(xiàn)出更優(yōu)的性能 : ⑴ 高動(dòng)態(tài)載量，一步結(jié)合大部分雜質(zhì)，節(jié)約時(shí)間和成本。⑵ 改良的 MaXtar®基架具有更強(qiáng)剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。⑶ 細(xì)粒徑設(shè)計(jì)，分辨率高。⑷ 耐受廣泛的 pH 和電導(dǎo)率范圍，有助于摸索最優(yōu)工 藝條件。
方法四、羥基磷灰石
BaronCHT®，羥基磷灰石 [Ca10(PO4)6(OH)2 ] 是一種無(wú)機(jī)純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，其晶體結(jié)構(gòu)與骨羥基磷灰石相同，且球體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑均勻。羥基磷灰石與生物分子之間具有多種模式的相互作用，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子交換和鈣金屬親和兩種分離機(jī)制。陽(yáng)離子交換主要依賴(lài)于羥基磷灰石上帶負(fù)電荷的磷酸基，同時(shí)，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通過(guò)金屬親和作用與羥基磷灰石上的鈣形成更強(qiáng)的結(jié)合。由于這些獨(dú)特的分離機(jī)制，使得羥基磷灰石廣泛應(yīng)用于抗體、 疫苗 ( 細(xì)菌多糖、肺炎多糖、病毒等 )、核酸、酶和重組蛋白等領(lǐng)域。其中BaronCHT® TypeⅡ在IgM上的純化應(yīng)用也普遍有著良好的純化效果。
IgM的純化案例
陰離子Q+羥基磷灰石二型兩步法純化
SEC結(jié)果結(jié)果可見(jiàn)兩步法純化后IgM純度可達(dá)99%
總結(jié)
純化 IgM 抗體是研究 IgM 抗體結(jié)構(gòu)和功能的重要前提。純化 IgM 的方法有多種，各種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇純化方法時(shí)，需要根據(jù)實(shí)際情況和需求進(jìn)行綜合考慮。對(duì)此，百林科在凝膠過(guò)濾法、離子交換層析法和親和層析法等幾種常用的IgM純化方法均擁有豐富的適用產(chǎn)品可供選擇進(jìn)行使用！
表：IgM純化選擇匯總
掃描二維碼，
百林科多款產(chǎn)品
均可試用！
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