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His-Tag 蛋白純化磁珠

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磁珠純化組氨酸標(biāo)簽蛋白，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行多次長(zhǎng)時(shí)間的高速離心和濾膜過(guò)濾、無(wú)需控制流速、更無(wú)需高昂
的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡(jiǎn)單、快速、易操作。對(duì)于熟練的操作者而
言，在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白，且能輕松實(shí)現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時(shí)間和
成本。

詳細(xì)介紹

1、緩沖液的準(zhǔn)備
目標(biāo)蛋白與組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一
定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應(yīng)該自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出適合純
化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系，主要包括 Binding Buffer、 WashingBuffer、 ElutionBuffer。
增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是組氨酸標(biāo)簽純化磁珠常用的洗脫方法，使用時(shí)，在不確定洗脫咪唑濃
度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10 mM、 20 mM、 50 mM、 100 mM、 200mM、 300mM、 400 mM、 500 mM
咪唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過(guò) SDS-PAGE 電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。
以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，供用戶參考。 Binding Buffer： 20 mM 磷酸緩沖液，
0~50 mM 咪唑， pH7.4 ； WashingBuffer： 20 mM 磷酸緩沖液， 50~100 mM 咪唑， pH7.4； Elution Buffer： 20mM
磷酸緩沖液， 100-500 mM 咪唑， pH7.4；
2、磁珠預(yù)處理
預(yù)估蛋白表達(dá)量，根據(jù) 30-40μg/mg 蛋白的結(jié)合量投入合適量的磁珠，假如預(yù)估表達(dá)量為 10-20mg，那么需要投入
500mg 的磁珠；
利用磁鐵或者磁力架去除磁珠保存液，加入保存液相同體積的 Bingding Buffer 清洗 3 次，每次上下翻轉(zhuǎn) 10-20 次，
去除上清液；建議磁性分離時(shí)間為 30-60s。
3、目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合
加入目標(biāo)蛋白樣品（建議目標(biāo)粗蛋白溶液與 Binding Buffer 相同，如過(guò)不同，建議使用超濾或者透析的方式進(jìn)行 Buffer
替換），震蕩混勻 30s，室溫或者冷藏旋轉(zhuǎn)混勻 10-30 分鐘（如果目標(biāo)蛋白溫度穩(wěn)定性差，可在冷藏條件下進(jìn)行，適
當(dāng)增加結(jié)合時(shí)間至 1-2 個(gè)小時(shí)）。
4、磁珠洗滌
加入合適體積的 Washing Buffer（建議體積為 1-2mL/100mg），顛倒混勻數(shù)次，磁性分離，去除上清，重復(fù)操作 3-
5 次直至沒(méi)有雜蛋白出現(xiàn)（建議使用分光光度計(jì) OD280 進(jìn)行質(zhì)量控制）；
5、目標(biāo)蛋白洗脫
用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入合適體積的 Elution Buffer，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸
浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品；如果需要，可以重復(fù)上述步驟 1 次，收集
樣品到新的離心管中，以檢測(cè)目標(biāo)蛋白是否洗脫*。
6、磁珠后處理
（1）在裝有磁珠的離心管中加入 2mL/100mg 的 500mM 咪唑，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去
除上清液。
（2）重復(fù)上述步驟 2 次。
（3）在離心管中加入 2mL/100mg 的 ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。
（4）重復(fù)上述步驟 2 次。
（5）加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 1 mL/100mg，保存于 2~30℃（長(zhǎng)期保存，置于 2~8℃），可用于
下一次同種蛋白的純化。
7、磁珠再生
磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會(huì)明顯降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。
Stripping Buffer： 20 mM 磷酸緩沖液， 500 mM NaCl， 100 mM EDTA， pH7.4
Beads Washing Buffer（可選）： 0.5 M NaOH， 2 M NaCl
Recharge Buffer： 100 mM NiSO4（該化學(xué)試劑有一定的毒性，可能造成過(guò)敏反應(yīng)，使用時(shí)務(wù)必注意）
Storage Buffer： 20%（v/v）乙醇
以 5 mL （500mg）磁珠懸液為例，詳細(xì)說(shuō)明磁珠再生操作：
（1）將磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入 5mLddH2O，上下翻
轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。（2）加入 5 mL Stripping Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，
使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次。
（3）加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復(fù)此步驟 2 次。
（4）堿處理：加入 5 mL Beads Washing Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5 min，
磁性分離，去除上清液。加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重
復(fù) ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。（5）加入 5 mL Recharge Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使
磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min，磁性分離，去除上清液。
（6）加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 6 次以上，
保證鎳離子去除*。
（7）加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 5 mL，保存于 2~30℃（長(zhǎng)期保存，置于 2~8℃）。