免疫熒光抗體法檢查細(xì)胞表面抗原

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

了解特異性免疫熒光抗體反應(yīng)的一般過程及其在細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用。

【實(shí)驗(yàn)用品】

一、材料和標(biāo)本 人體結(jié)腸癌培養(yǎng)細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞、小鼠抗人結(jié)腸癌細(xì)胞抗體（*抗

體）、熒光標(biāo)記羊抗鼠抗體（第二抗體）。

二、器材和儀器 蓋片、載片、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、吸管、普通倒置顯微

鏡，熒光顯微鏡、微量加樣器。

三、試劑 1640 培養(yǎng)液（加 lO％小牛血清）、甲醛固定液、0.01mol/L PBS（Ph7.2）、液

體石蠟。

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

一、原理和意義

用人結(jié)腸癌細(xì)胞為免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人結(jié)腸癌細(xì)胞表面抗原（Ag）的單克隆

抗體 IgG（*抗體），二者可以發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，再加

入市售（也可自制）的熒光標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 抗體（第二抗體），可以與復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)生抗

原抗體反應(yīng)（二次抗體反應(yīng)），這樣就可以在熒光顯微鏡下觀察到這種抗原在結(jié)腸癌細(xì)胞表

面的存在（圖 19—1）。

圖 19 一 l 特異性一次、二次抗原抗體反應(yīng)過程

二、方法

1．將培養(yǎng)瓶中的結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裝有蓋片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 2～3 天。

2．在倒置鏡下觀察到蓋片上的細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，在蓋片左上角用玻璃筆做一下標(biāo)

記，以免在以后的操作中正反面顛倒。

3．將蓋片放在甲醛固定液中，4℃固定 5~10 分鐘。

4．用 PBS 洗三次，注意不要將 PBS 液直接倒在蓋片的細(xì)胞面，以免引起細(xì)胞大量丟失。

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用濾紙片將蓋片上的 PBS 輕輕吸干，不要損傷細(xì)胞層。

5．將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上．每個(gè)蓋片 50μl，37℃溫育 30 分鐘。

6．用 PBS 洗三次，濾紙吸干。

7．將已稀釋好的熒光標(biāo)記羊抗鼠二次抗體 5μl 滴加在蓋片上，37℃溫育 30 分鐘。

8．用 PBS 洗三次，濾紙吸干。

9．將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細(xì)胞面朝下放到載玻片上，在熒光顯微鏡下

觀察。

三、結(jié)果

細(xì)胞多成團(tuán)塊狀存在，細(xì)胞膜表面顯示黃綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)及背景均不發(fā)光。每組應(yīng)

設(shè)立一個(gè)陰性對照組，以培養(yǎng)的 HeLa 細(xì)胞為抗原，操作步驟相同。