圖注：（A）Mir505 基因位于一個(gè)調(diào)控雌鼠性發(fā)育的數(shù)量性狀座位上。（B）Mir505 基因位于一個(gè)影響人類 X 染色體連鎖的垂體發(fā)育不良癥的數(shù)量性狀座位上。（C）在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 調(diào)控神經(jīng)元極性建立、軸突生長(zhǎng)和軸突分支。（D）體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)結(jié)果顯示，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 促進(jìn)皮層神經(jīng)元在對(duì)側(cè)腦室軸突生長(zhǎng)和軸突分支。（E）甲苯胺藍(lán)染色指示 Mir505 敲除小鼠胼胝體處軸突發(fā)育異常。（F）透射電鏡結(jié)果顯示，Mir505 敲除小鼠皮層腦組織中自噬小體數(shù)目和面積增加，線粒體數(shù)目減少。F 圖中綠色偽彩指示自噬小體，藍(lán)色偽彩指示線粒體。（G）免疫熒光染色指示 Mir505 敲除小鼠的胼胝體、扣帶皮層和海馬傘處軸突發(fā)育異常，但扣帶皮層處成熟神經(jīng)元數(shù)目正常。（H）Mir505-3p 通過 Atg12/ 自噬通路調(diào)控神經(jīng)元軸突發(fā)育的機(jī)制圖。

8 月 19 日，細(xì)胞自噬領(lǐng)域的核心期刊《自噬》在線發(fā)表了題為《Mir505-3p 通過調(diào)控 Atg12 及自噬通路以影響神經(jīng)元軸突發(fā)育》的研究論文。該研究由東華大學(xué)化工生物學(xué)院周宇荀團(tuán)隊(duì)與中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)創(chuàng)新中心仇子龍研究組合作完成。該研究利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了 Mir505 基因敲除小鼠，結(jié)合胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)和透射電鏡技術(shù)，報(bào)道了 Mir505-3p 基因通過靶向抑制自噬相關(guān)基因 Atg12，負(fù)向調(diào)控自噬通路并促進(jìn)神經(jīng)元軸突發(fā)育的新功能。該研究提供了自噬對(duì)神經(jīng)發(fā)育調(diào)控作用的新證據(jù)?！　?/p>

“自噬”即“自我吞噬”，是一種將體內(nèi)衰老細(xì)胞器和包漿中內(nèi)含物包裹、降解并得以循環(huán)利用的途徑。自噬zui顯著的特點(diǎn)是需要合成名叫“自噬小體”的多層膜結(jié)構(gòu)，在這種膜結(jié)構(gòu)的包裹和呈遞下，內(nèi)含物進(jìn)入溶酶體系統(tǒng)并得以降解。盡管從上世紀(jì)七十年代起，神經(jīng)元已是zui早一批用來觀察和鑒定細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)的細(xì)胞之一，但細(xì)胞自噬是如何廣泛地影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)退行性病變發(fā)生，以及如何調(diào)控軸突損傷后再生缺乏詳盡研究。近年來，關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞自噬的基礎(chǔ)與臨床研究以及自噬通路關(guān)鍵基因動(dòng)物模型的研究已成為目前醫(yī)學(xué)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)領(lǐng)域的重要課題?！　?/p>

周宇荀團(tuán)隊(duì)在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與小鼠性發(fā)育相關(guān)的數(shù)量性狀座位（圖 A），并且發(fā)現(xiàn) Mir505 基因是潛在的調(diào)控者。另一項(xiàng)針對(duì)人 X 染色體連鎖的垂體發(fā)育不良癥的研究表明，Mir505 同樣位于調(diào)控該疾病的數(shù)量性狀座位上（圖 B）。由于哺乳動(dòng)物性發(fā)育和垂體發(fā)育的本質(zhì)都是神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，因此，東華大學(xué)的科研人員試圖在神經(jīng)系統(tǒng)中考察 Mir505 基因是否影響神經(jīng)發(fā)育事件，并由此展開了與中科院神經(jīng)科學(xué)研究所仇子龍研究組的課題合作。

科研人員首先利用體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元模型驗(yàn)證 Mir505 基因是否參與調(diào)控神經(jīng)元發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，Mir505 基因的一個(gè)成熟體 Mir505-3p 特異性促進(jìn)神經(jīng)元極性建立、軸突生長(zhǎng)和軸突分支，但不影響樹突發(fā)育；而另一個(gè) Mir505 基因的成熟體則不具備這一功能?？蒲腥藛T利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)在小鼠體內(nèi)皮層組織中觀察到了同樣表型。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，科研人員在神經(jīng)元中篩選出 Mir505-3p 的靶基因?yàn)樽允上嚓P(guān)基因 Atg12。Atg12 是細(xì)胞自噬通路上一個(gè)關(guān)鍵基因，其編碼的 ATG12 蛋白分子與 ATG5 蛋白和 ATG16L1 蛋白形成復(fù)合物，調(diào)控自噬小體早期形成和延伸。在本項(xiàng)研究之前，Atg12 是否參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育事件并不清楚。

為了研究 Atg12 對(duì)于神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的功能，科研人員在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中分別運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染兩種方式過表達(dá) Mir505-3p 以及 Atg12，發(fā)現(xiàn) Atg12 顯著抑制神經(jīng)元極性建立、軸突生長(zhǎng)以及軸突分支，這些現(xiàn)象與 Mir505-3p 展現(xiàn)的功能相反。并且，共轉(zhuǎn) Mir505-3p 可以恢復(fù) Atg12 對(duì)于神經(jīng)元軸突發(fā)育的抑制效果（圖 C），這初步證實(shí)了 Atg12 抑制體外神經(jīng)元軸突發(fā)育的現(xiàn)象?？蒲腥藛T利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)觀察到，過表達(dá) Atg12 可以恢復(fù) Mir505-3p 對(duì)于體內(nèi)同側(cè)皮層和對(duì)側(cè)皮層神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和分支的促進(jìn)效果（圖 D），進(jìn)一步證實(shí)了 Atg12 抑制體內(nèi)神經(jīng)元軸突發(fā)育的現(xiàn)象。

為了進(jìn)一步研究 Mir505-3p 對(duì)于小鼠神經(jīng)元軸突發(fā)育是否必需，科研人員利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建了 Mir505 基因特異性敲除的基因工程小鼠。通過 HE 染色、甲苯胺藍(lán)染色（圖 E）以及免疫熒光染色（圖 G），科研人員觀察到 Mir505 敲除小鼠在胼胝體、扣帶皮層和海馬傘等軸突富集區(qū)域信號(hào)減弱，但扣帶皮層處的成熟神經(jīng)元數(shù)目沒有顯著變化（圖 G）。這提示，Mir505 基因敲除小鼠軸突信號(hào)減弱的原因并不是神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖受干擾，而是因?yàn)?Mir505-3p 對(duì)于小鼠軸突正常發(fā)育是必需的。利用這一小鼠模型，科研人員在透射電鏡下觀察到，在 Mir505 敲除小鼠體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和小鼠皮層組織中（圖 F）自噬小體發(fā)生顯著變化?；蚯贸∈蟮淖允尚◇w數(shù)目和面積顯著增加，而線粒體數(shù)目顯著減少。這表明，Mir505-3p 對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)正常自噬信號(hào)是必需的，敲除 Mir505 基因引起神經(jīng)系統(tǒng)中自噬通路整體激活。研究表明，軸突發(fā)育過程涉及細(xì)胞微管系統(tǒng)骨架蛋白重排、膜蛋白以及眾多極性蛋白分子的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)，這些事件的發(fā)生均依賴于神經(jīng)元充足的能量供給，因此，軸突局部的線粒體分布和線粒體移動(dòng)性對(duì)于軸突生長(zhǎng)和分支至關(guān)重要。Mir505 基因敲除小鼠神經(jīng)元胞體和軸突局部自噬小體增多并伴隨線粒體數(shù)目減少，進(jìn)一步提示 Mir505-3p zui終通過自噬通路調(diào)控軸突局部線粒體分布以影響神經(jīng)元軸突發(fā)育?？蒲腥藛T在原代培養(yǎng)的 MEF 細(xì)胞中證實(shí)，Mir505-3p 通過抑制 Atg12 廣泛影響著細(xì)胞自噬通路以及線粒體數(shù)目。

此工作利用神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型、體內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)、電鏡技術(shù)和基因工程小鼠模型共同鑒定了 Mir505-3p 調(diào)控神經(jīng)元軸突發(fā)育的表型，報(bào)道了 Mir505-3p 在神經(jīng)系統(tǒng)中的靶基因是自噬相關(guān)基因 Atg12，突出了 microRNA 和細(xì)胞自噬對(duì)于神經(jīng)元軸突發(fā)育的關(guān)鍵作用，提出了 Mir505-3p 通過調(diào)控 Atg12/ 自噬通路以影響軸突局部線粒體分布的全新信號(hào)通路及其分子機(jī)制（圖 H），對(duì)深入理解自噬通路對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控有重要意義。