聯(lián)系電話
- 聯(lián)系人:
- 程成
- 電話:
- 021-60348496
- 手機(jī):
- 18121453965
- 傳真:
- 021-51632657
- 地址:
- 上海市松江加工園區(qū)
- 網(wǎng)址:
- www.qiyibio.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
微信掃碼進(jìn)入微名片
人黑色素抗體(Melanin-Ab)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用于測定人血清,血漿及相關(guān)
液體樣本中黑色素抗體(Melanin-Ab)的含量。
實(shí)驗(yàn)原理:
本試劑盒應(yīng)用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中人黑色素抗體(Melanin-Ab)水平。用純化的人
黑色素(Melanin)抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被抗原的微孔中加入黑色素抗體
(Melanin-Ab) ,再與 HRP 標(biāo)記的黑色素(Melanin)抗原結(jié)合,形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原
復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸
的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的黑色素抗體(Melanin-Ab)呈正相關(guān)。
用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值) ,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人黑色素抗體
(Melanin-Ab)的濃度。
試劑盒組成:
試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存
說明書 1 份 1份
封板膜 2片(48) 2片(96)
密封袋 1 個(gè) 1個(gè)
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品:90IU/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
顯色劑 B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30 倍)×1瓶 2-8℃保存
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分) 。仔細(xì)收集上
清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20 分鐘后,離心
20 分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分) 。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分) 。仔細(xì)收集上清,保存過程
中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心 20分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/
分) 。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用 PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞2
濃度達(dá)到 100萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分
鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分) 。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br>用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS(PH7.4) ,用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右(2000-3000 轉(zhuǎn)/分) 。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待
檢測,其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含 NaN3的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔,在*、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品 100μl,然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,混勻;然后從*孔、第二
孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔, 再在第三、 第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,
混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉,再各取 50μl 分別加到第五、第六孔
中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各
取 50μl 分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,混
勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液 50μl,混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。 (稀釋后各孔加樣量都為 50μl,
濃度分別為 60 IU/L,40 IU/L, 20 IU/L,10 IU/L,5 IU/L) 。
2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同) 、待測樣
品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 50μl,然后再加待測樣品 10μl(樣
品zui終稀釋度為 5 倍) 。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混
勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30分鐘。
4. 配液:將 30(48T 的 20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T 的 20 倍)倍稀釋后備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此
重復(fù) 5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同 3。
8. 洗滌:操作同 5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色) 。
11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD 值) 。 測定應(yīng)在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng):
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未
用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間
控制在 5 分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本 OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值) ,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計(jì)
算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5) 。3
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn)。
計(jì)算:
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD 值為縱坐標(biāo),
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的 OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋
倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD 值
代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。
(此圖僅供參考)
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92以上。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和 15%
檢測范圍:
1 IU/L -60 IU/L
保存條件及有效期:
1.試劑盒保存:2-8℃。
2.有效期:6 個(gè)月