展青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒

1．概述

展青霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒是利用競爭性的酶聯(lián)反應(yīng)原理，用于飼料、蜂蜜、肉類（牛肉、雞肉和豬肉）、魚蝦、牛奶、組織、血清和尿液中展青霉素殘留的定量檢測。

該試劑盒具有以下特點：

• 快速，高回收率(75-95%)，多種樣品的低成本提取方法。
• 高靈敏度（0.1ng/g或ppb），低檢測下限（牛奶0.5ng/g或ppb）。
• 高重復(fù)性。
• 檢測過程只需要不到1.5小時。

展青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒2．試劑盒原理

展青霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒基于競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理，含有展青霉素的抗體已經(jīng)包被于微孔板上。藥物分析時，樣品同酶標(biāo)抗原被添加到板孔中。如果樣品中含有藥物，會競爭抗體，抑制抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合。加入底物后，產(chǎn)物的顏色強弱與樣品中藥物的濃度成反比。

3．試劑盒組成

本試劑盒應(yīng)當(dāng)在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果超過1個月不使用試劑盒，請

將展青霉素HRP酶標(biāo)記物 放置-20℃或者冰凍保存。

展青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒

4．檢測限

5．交叉反應(yīng)

6．未提供的設(shè)備或材料

• 酶標(biāo)儀
• 恒溫培養(yǎng)箱
• 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)
• 漩渦振蕩器
• 勻質(zhì)器
• 多道移液器（50-300mL）

7．注意事項

實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得實驗效果。

• 標(biāo)準(zhǔn)品中含有展青霉素，請小心使用。
• 不要使用過期的試劑盒。
• 不同批次的試劑盒不要混用，酶標(biāo)記物和微孔板具有盒與批次的特異性。確保其正確使用。
• 盡量保持室溫20-25℃，避免在通風(fēng)口操作防止溫度過低，過熱蒸發(fā)。同樣的，不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發(fā)。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應(yīng)該鋪墊若干紙巾或者其他物料。
• 水質(zhì)量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。
• 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。
• 孵育時間的計算越規(guī)范越好，保持添加標(biāo)準(zhǔn)品的一致性，先添加標(biāo)準(zhǔn)品后添加樣品。
• 從低濃度到高濃度地添加標(biāo)準(zhǔn)品，降低影響標(biāo)準(zhǔn)品曲線質(zhì)量的風(fēng)險。
• 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。

8．試劑的準(zhǔn)備

所有的試劑在使用之前應(yīng)將其回溫至室溫，并在使用試劑前搖動幾下，以保證合理的濃度。

（1）1×樣品提取液

按1：9的比例配制10×樣品提取液和蒸餾水。

（2）35%的(甲醇)/(樣品提取液)溶液

按6.5：3.5的比例配制1×樣品提取液和100%的甲醇。

9．樣品的準(zhǔn)備

(樣品在使用前請保存在2-4°C下)

飼料

• 取一定量的樣品，添加5倍的70%的甲醇（如：1g樣品中加入5mL的70%的甲醇），漩渦振蕩混勻；
• 取1.5mL勻質(zhì)樣品，室溫下4000g離心5分鐘。
• 取0.5ml 上清液，加入0.5ml 1x 樣品提取液，混勻。
• 每孔取100μl用于檢測。

稀釋倍數(shù)：10

 蜂蜜

• 稱取0.1g蜂蜜樣品，加入1.9ml的35%乙醇/樣品提取液，混勻
• 每孔取100ul用于檢測。

稀釋倍數(shù)：20

肉類/肝臟/腎臟/魚/蝦

• 取1g 勻質(zhì)去脂肪樣品，加入4ml 70% 甲醇。
• 轉(zhuǎn)速渦流震蕩10分鐘。
• 室溫下4000g 離心5分鐘。
• 取0.5ml 上清液，加入0.5ml 1x 樣品提取液，混勻。
• 每孔取100μl用于檢測。

稀釋倍數(shù)：10

牛奶

• 有脂肪的奶粉，取1ml牛奶，4000g離心5分鐘，去除上層脂肪。(脫脂奶粉省略這一步)
• 取200μl牛奶樣品，加入800μl 35% 甲醇/樣品提取液，混勻。
• 每孔取100μl 用于檢測。

稀釋倍數(shù)： 5

血清/尿液

• 取0.5mL 樣品，在4000g離心5分鐘；
• 取,0.2 mL上清液，加入0.8mL 35% 甲醇/樣品提取液，混勻。
• 每孔取100μl 進行檢測。

稀釋倍數(shù)：5

10．酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試步驟

所有試劑使用前回到室溫，試驗中用到的試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，多余的試劑不能倒回原先的瓶子里，避免試劑的交叉污染。

1×工作洗液

按1：19的比例配制濃縮洗液和雙蒸餾水。

檢測

以下為計算份量的表格，用戶可根據(jù)自己的需要來確定需要配置多少試劑。

• 加入100mL的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品于所設(shè)定的孔中；
• 每孔加入50mL 酶標(biāo)（避免陽光直射和工作臺溫度過低，孵育時適當(dāng)覆蓋微孔板）；
• 室溫（20-25℃）孵育60分鐘；
• 洗板3次，每次應(yīng)該加入250mL，一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
• 加入100mL的TMB底物（底物本身是無色的，出現(xiàn)顏色變化不能使用。孵育時適當(dāng)覆蓋微孔板）；
• 加入底物后立即計時，輕敲試劑盒使混勻；
• 在室溫下培養(yǎng)15分鐘，加入100mL的終止液終止反應(yīng)，在450nm下讀OD值(讀數(shù)前用無絨布擦拭微孔底部水分和指模)。

11．結(jié)果計算

（1）分別計算標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。

相對吸光度值 (%) =(標(biāo)準(zhǔn)或樣品吸光度值/零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值) ´ 100

（2）以相對吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和樣品的濃度值。

  展青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒備注：如結(jié)果呈陽性反應(yīng)，應(yīng)該用其他檢驗方法（如色譜/質(zhì)譜方法等）進行確證。

以下曲線圖是展青霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒典型標(biāo)準(zhǔn)曲線