動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀初,發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法, 利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等, 已成為醫(yī)藥生物高技術產(chǎn)業(yè)的重要部分。
由于動物細胞體外培養(yǎng)的生物學特性、相關產(chǎn)品結構的復雜性和質(zhì)量以及一致性要求, 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術仍難于滿足具有重要醫(yī)用價值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求, 迫切需要進一步研究和發(fā)展細胞培養(yǎng)工藝。目前, 世界眾多研究領域集中在優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。
細胞培養(yǎng)定義：
細胞培養(yǎng)是將活體組織或細胞從試驗動物體內(nèi)取出，放在模擬體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境(無菌、適溫、營養(yǎng)豐富)中，使高體細胞生長、發(fā)育的一種方法。按照培養(yǎng)的結構成分不同，將其分為組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及器官培養(yǎng)等。根據(jù)細胞是否在支持物上生長，將其分為貼壁型和懸浮型。一般來說，圓形細胞如淋巴細胞屬于懸浮型，而胞體梭型(成纖維型細胞)、扁平不規(guī)則(上皮型細胞)等屬于貼壁型，貼壁型細胞必需貼附在支持物表面生長。
細胞培養(yǎng)目前主要應用于：
1、在病毒學中的應用
2、在腫瘤學中的應用
3、在藥理學中的應用
4、在動物生產(chǎn)中的應用
5、在其他方面的應用
本節(jié)引自：占今舜的《細胞培養(yǎng)技術的應用研究進展》
?
1 細胞培養(yǎng)環(huán)境
細胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細胞密度的主要限制因素。
1、體外動物細胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一。氨來源于兩方面:一是直接來源于培養(yǎng)基, 一是細胞代謝所產(chǎn)生。但兩者都涉及谷氨酰胺, 因此需要防止培養(yǎng)基中Gln 自然分解, 限制Gln 用量, 并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。
2、乳酸是細胞糖代謝的產(chǎn)物：其中比較有效果的措施是降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時, 必須平衡葡萄糖和Gln 的比例。這些代謝改變機理的研究將有利于設計適當?shù)目刂品桨浮?br />
3、隨著細胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大, 二氧化碳的產(chǎn)生速率比通過換氣從培養(yǎng)基中去除二氧化碳快因而導致CO2 積聚, 從而對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平。所以控制通氣參數(shù), 平衡氧的輸送及CO2 的去除, 防止生物反應器運轉(zhuǎn)中CO2 積聚仍是明智選擇。
4、甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基
后的代謝產(chǎn)物, 也是脂類、氨基酸代謝的產(chǎn)物, 對于細胞有潛在的損傷作用。通過批次培養(yǎng)中限制葡萄糖用量來降低葡萄糖消耗, 由此來確定降低糖酵解代謝是否導致細胞內(nèi)MG 濃度降低, 從而zui終確定MG 濃度降低。
5、滲透壓對細胞的生長抑制作用。高滲透壓不僅影響細胞批次培養(yǎng)中產(chǎn)量, 而且影響細胞生長速度、對數(shù)生長期的長短、細胞死亡的速度等?？梢杂肗aCl 、KCl 還是蔗糖濃度調(diào)節(jié)滲透壓。
6、機械攪拌與噴氣損傷。目前用多孔微載體替代了容易使細胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。
2 細胞死亡與凋亡
大規(guī)模細胞培養(yǎng)的后期, 維持細胞高的活力是個富有挑戰(zhàn)性的課題。zui初的研究似乎表明細胞死亡大多由于壞死, 而人們逐漸認識到至少是一些細胞系在生物反應器中細胞死亡主要原因是細胞凋亡。隨著細胞凋亡分子機制研究的不斷深入, 細胞凋亡的發(fā)生被認為是大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié), 預防并控制細胞凋亡也因此成為研究熱點。用基因工程方法將bcl -2 基因這種細胞凋亡抑制基因?qū)爰毎? 成為眾多研究者的選擇。
發(fā)酵人，大家的好伙伴
3 培養(yǎng)基與細胞系
動物細胞培養(yǎng)基是細胞賴以體外生長、增殖、分化的重要因素。在經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)后, 無血清培養(yǎng)基成為當今細胞培養(yǎng)領域研究的一大課題。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于避免了血清的批次、質(zhì)量、成分等對細胞培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。
zui近研究表明, 先使野生型宿主CHO細胞適應無血清培養(yǎng)基培養(yǎng), 然后轉(zhuǎn)染這些細胞得到的重組克隆在基因擴增后保持了在無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中的生長能力, 其產(chǎn)品在生化和結構上類似于未處理的宿主細胞產(chǎn)物。
?
4 過程監(jiān)控
大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝,細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變, 在線過程監(jiān)控更為重要。在生物反應器中, 溫度、pH 值、溶解氧濃度是細胞培養(yǎng)規(guī)模放大的早期研究內(nèi)容?，F(xiàn)在, 這三個參數(shù)對細胞的影響已經(jīng)明確, 并在培養(yǎng)過程中實行了有效控制。
測量在線氧吸收速率確定從細胞生長期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時間;用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度;測定氧消耗估計營養(yǎng)供應率的代謝負荷和控制;測定氧吸收速率估測ATP 的形成;測量在線氧化還原能力作為活細胞濃度的指標等等眾多特定參數(shù)均得以測定并加以應用。用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進行在線蛋白質(zhì)含量測定的方法已經(jīng)完成。另外, 用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的一致性也成為一項有應用價值的技術。
1~4引自林福玉《大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策》
5 三維立體微環(huán)境
細胞生長離不開三維立體微環(huán)境中各種細胞因子、生長因子、細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)( extra - cellular matrix，ECM) 間相互粘附等多種信號的調(diào)節(jié)。體外細胞培養(yǎng)技術就是在體外維持細胞、組織及器官生存及生長的一種技術
細胞培養(yǎng)技術經(jīng)過不斷的改進，經(jīng)歷了由二維到三維，由靜止三維培養(yǎng)到動力三維培養(yǎng)的過程。本節(jié)引自宋鴻《細胞培養(yǎng)技術的研究進展》
6 微生物污染及處理方法
細胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。生物污染一般包括：細菌、霉菌、支原體、病毒、黑蛟蟲污染，還有細胞交叉污染。下面主要對黑蛟蟲污染進行簡述。
黑蛟蟲是一種生物還是非生物，學術界還有爭論。其污染特點為開始對細胞無影響，當數(shù)量達到一定程度時就會對細胞產(chǎn)生影響。受黑蛟蟲污染的細胞液通常清亮無變化。污染主要來源于血清，400倍顯微鏡下可見點狀或片狀游動小體。
黑蛟蟲早期污染一般采用如下方法: 用0.25%的胰酶消化，當有少量細胞變圓或脫壁時，用血清終止消化，輕輕用培養(yǎng)基或D-Hanks 液清洗3 遍( 緩慢流過細胞表面) ，不要吹打，然后吹散細胞，換培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，隔天換液。2 d 后重復一次，以后每24 ～ 36 h換1 次液，1周后，黑點可基本消失。也可用麥諾霉素10 mg /L 處理，連續(xù)1 周，但麥諾霉素對細胞有毒性。
本節(jié)引自吳文亮《細胞培養(yǎng)中污染的防控措施》
