融解曲線中那些令你頭疼的問(wèn)題

融解曲線中那些令你頭疼的問(wèn)題，全面解析看這里！

我們?cè)谧鋈玖戏?SYBR Green qPCR時(shí)，除了要看擴(kuò)增曲線的C_T值大小外，另一個(gè)重要的指標(biāo)是融解曲線是否為單峰。那您知道融解曲線是怎么來(lái)的嗎？為什么說(shuō)它是染料法 SYBR Green qPCR的重要指標(biāo)之一呢？我們現(xiàn)在就來(lái)一起了解一下。

01，什么是融解曲線

要明確融解曲線的重要性，我們需要先知道染料法 SYBR Green qPCR的化學(xué)原理。

染料法 SYBR Green qPCR的體系中添加了一種DNA雙鏈小溝結(jié)合染料, 即SYBR Green。它與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光，游離時(shí)不發(fā)光，所以每形成一條DNA雙鏈，就會(huì)有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去，就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。

但是SYBR Green 只是識(shí)別DNA 雙鏈的小溝結(jié)構(gòu)，當(dāng)qPCR體系中存在非特異性產(chǎn)物時(shí)，SYBR Green 同樣可以和這些非特異性產(chǎn)物的DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出熒光。所以儀器檢測(cè)到的熒光值其實(shí)為qPCR目的產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物熒光值的總和，那得到的C_T值自然是不準(zhǔn)確的了。所以使用染料法qPCR，前提為qPCR擴(kuò)增體系一定要特異。

qPCR擴(kuò)增結(jié)束后，將溫度逐漸升高至95℃，DNA雙鏈也逐步解離為單鏈，DNA小溝結(jié)構(gòu)逐步消失，SYBR Green 從雙鏈中游離出來(lái)，熒光值降低。當(dāng)溫度達(dá)到 DNA 解鏈一半的溫度時(shí)，也就是 Tm 值時(shí)，SYBR Green 會(huì)大量游離出來(lái)，熒光強(qiáng)度隨之會(huì)出現(xiàn)突然下降，直至為0。這個(gè)反應(yīng)熒光值變化的曲線即為融解曲線。

以ABI Q3軟件的融解曲線程序設(shè)置為例（參見(jiàn)上圖）：所有的DNA單鏈在60℃下全退火形成雙鏈后，溫度逐漸升高至95℃（升溫速度為0.15℃/sec），DNA雙鏈逐漸解鏈為單鏈。儀器檢測(cè)到該過(guò)程熒光信號(hào)的改變，即可得到融解曲線的熒光圖譜。

逐漸升溫至95℃過(guò)程中，雙鏈逐漸打開(kāi)，熒光值高度下降

上圖為擴(kuò)增曲線與融解曲線的原始圖譜，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光值。前40個(gè)循環(huán)即為擴(kuò)增曲線，40個(gè)循環(huán)之后為融解曲線?？梢?/span>看到隨著循環(huán)數(shù)增加，熒光值逐漸下降，當(dāng)到達(dá)Tm值時(shí)，剩余雙鏈迅速解開(kāi)，熒光值迅速降低至0。

但我們平時(shí)看到的融解曲線是下面的這張圖譜。它是由融解曲線原始圖譜上每個(gè)點(diǎn)取負(fù)倒數(shù)而得到的。其橫坐標(biāo)表示溫度，波峰值對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)的溫度值，即為T(mén)m值。如我們圖中所示的融解曲線的Tm值為87℃。

02，融解曲線的作用是什么

融解曲線的Tm值是融解曲線中的重要參數(shù)，在使用同一qPCR試劑下，目標(biāo)基因融解曲線的Tm值是由其產(chǎn)物長(zhǎng)度與GC含量決定的。目標(biāo)基因的qPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度越長(zhǎng)、GC含量越高，Tm值越大。不同的qPCR產(chǎn)物因其長(zhǎng)度與GC含量不同，它們的Tm值大小也不一樣。

如下圖所示，基因1 qPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度較基因2 qPCR產(chǎn)物短，那融解曲線表現(xiàn)出基因1的Tm值低于基因2的Tm值。

同理，如果qPCR擴(kuò)增體系不特異，出現(xiàn)一個(gè)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，那qPCR產(chǎn)物即由目的產(chǎn)物與非特異性產(chǎn)物共同構(gòu)成，因兩者長(zhǎng)度與GC含量不同，在融解曲線上會(huì)表現(xiàn)出兩個(gè)Tm值，即兩個(gè)波峰；若非特異性產(chǎn)物Tm值與目的條帶的Tm值接近，融解曲線可能出現(xiàn)寬峰。