一、支原體污染檢測(cè)

1.     支原體檢測(cè)方法概述

支原體污染嚴(yán)重干擾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)有無(wú)支原體污染的方法較多，可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室條件、檢測(cè)方法便捷性等作出選擇。

= 1 \* GB3 ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察。用掃描電鏡或透射電鏡，直觀觀察支原體形態(tài)。或者在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)預(yù)置蓋玻片，接種細(xì)胞在蓋玻片上，培養(yǎng)24小時(shí)后取出用油鏡觀察。如有支原體，因支原體與細(xì)胞在不同平面，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝。缺點(diǎn)：設(shè)備要求嚴(yán)格，檢測(cè)成本高，不適合普通實(shí)驗(yàn)室日常常規(guī)檢測(cè)。

= 3 \* GB3 ③DNA熒光染色法，利用支原體沒(méi)有細(xì)胞膜（壁）的特性，用熒光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能與支原體DNA結(jié)合著色，在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)綠色小點(diǎn)。缺點(diǎn)：靈敏度太低，當(dāng)檢測(cè)成陽(yáng)性時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。

= 4 \* GB3 ④培養(yǎng)法，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體，是相對(duì)可靠的支原體檢測(cè)技術(shù)。缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)，需要數(shù)周時(shí)間才能得到結(jié)果，不適合作為細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測(cè)。此外，該方法不能檢測(cè)豬鼻支原體，因?yàn)樨i鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見(jiàn)的菌落，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%。

= 5 \* GB3 ⑤PCR法，提取細(xì)胞培養(yǎng)液，提取支原體，制備樣品，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設(shè)計(jì)引物（避免真核細(xì)胞或細(xì)菌DNA干擾），設(shè)置陰性，陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察，可識(shí)別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體。

= 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速檢測(cè)法，拓?fù)涿腑h(huán)化支原體DNA，在根據(jù)高保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物引導(dǎo)下，采用特殊等溫DNA擴(kuò)增酶，61℃條件下，連續(xù)滾環(huán)式擴(kuò)增支原體DNA 60分鐘，根據(jù)有無(wú)支原體污染，隨著擴(kuò)增進(jìn)程可目視實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

= 7 \* GB3 ⑦化學(xué)發(fā)光法，裂解支原體后，有底物情況下，支原體特異性的酶，能將ADP轉(zhuǎn)化成ATP。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過(guò)程，所以可以通過(guò)催化底物熒光素導(dǎo)致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號(hào)來(lái)判別支原體DNA存在與否。

綜上所述，在多種支原體檢測(cè)方法中，受實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)、便捷性等因素限制， = 1 \* GB3 ①- = 4 \* GB3 ④僅在很少情況下得到應(yīng)用。實(shí)際科研工作中，應(yīng)用的是 = 5 \* GB3 ⑤ PCR支原體檢測(cè)法； = 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速支原體檢測(cè)法； = 7 \* GB3 ⑦化學(xué)發(fā)光支原體檢測(cè)法。

2.     幾種zui常用支原體檢測(cè)方法比較

檢測(cè)方法	Quick Cell快速檢測(cè)法	化學(xué)發(fā)光法	PCR法
檢測(cè)原理	環(huán)化DNA等溫連續(xù)擴(kuò)增	支原體特異性酶檢測(cè)	根據(jù)支原體DNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
實(shí)驗(yàn)條件	恒溫水浴或PCR儀	-80℃超低溫冰箱，多功能酶標(biāo)儀或發(fā)光檢測(cè)儀	常規(guī)PCR儀，電泳儀，成像系統(tǒng)
靈敏度	比PCR法高1-2個(gè)數(shù)量級(jí)	與PCR法相當(dāng)	較靈敏
檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)	1小時(shí)	25分鐘	2-3小時(shí)
定性/定量	定性	定性，半定量	定性，半定量
污染 假陽(yáng)性率	低	低	高
引物 假陽(yáng)性率	零	零	高
樣品制備	直接取上清，不需制備	需要樣品制備	離心
檢出 正確率	>99%	>99.9%	>80%
綜合評(píng)價(jià)	1）簡(jiǎn)便、快速，任何實(shí)驗(yàn)室均可操作；2）擴(kuò)增不受細(xì)胞代謝產(chǎn)物影響，高準(zhǔn)確率	1）快速，準(zhǔn)確；2）有特定設(shè)備要求，物流儲(chǔ)存條件高。	1）較高的檢出準(zhǔn)確率；2）PCR反應(yīng)易受培養(yǎng)基成分抑制，產(chǎn)生假陰性；3）需制備樣品。
代表性 產(chǎn)品	Quick Cell 快速支原體檢測(cè)（李記生物, CAT:C4056L1060） *本產(chǎn)品由細(xì)胞專家李記生物*研發(fā)	Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測(cè)試劑盒（李記生物,CAT:C4056L1065） MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (Lonza, CAT: LT07-710)	Quick Cell 支原體PCR檢測(cè)試劑盒（李記生物,貨號(hào): C4056L1062） Lookout Mycoplasma Detection Kit.（Sigma貨號(hào):MP0035）

3.     支原體檢測(cè)策略及方法選擇

①單個(gè)方法獨(dú)立檢測(cè)支原體（正確檢出率80%-99.9%）

就單個(gè)檢測(cè)方法及原理而言，“化學(xué)發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%），用時(shí)zui短，應(yīng)為方法?？蛇x產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價(jià)格：約9800元/100次），或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測(cè)試劑盒（CAT:C4056L1065，價(jià)格：1250元/50次）”。

若受實(shí)驗(yàn)室條件所限沒(méi)有配備化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，或多功能酶標(biāo)儀，建議選擇“Quick Cell快速檢測(cè)法”，該方法1小時(shí)出結(jié)果，避免了PCR法因細(xì)胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致的假陰性出現(xiàn)，正確檢出率大于99%，對(duì)設(shè)備幾乎無(wú)要求，可目測(cè)結(jié)果。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測(cè)試劑盒（CAT:C4056L1060，價(jià)格：1250元/50次）”。

 ②多原理支原體檢測(cè)策略

市場(chǎng)在售的所有支原體檢測(cè)試劑盒，目前沒(méi)有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細(xì)胞治療、進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)血清、胰酶、培養(yǎng)液工作的科研人員，強(qiáng)烈建議選擇兩種以上檢測(cè)方法，確保支原體正確檢出率達(dá)到*，避免關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)不必要的損失。

細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染是個(gè)普遍性問(wèn)題，污染來(lái)源很多，根據(jù)國(guó)外生物實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范做法，實(shí)驗(yàn)室的支原體檢測(cè)要定期進(jìn)行，一般一個(gè)月做一次支原體檢測(cè)，可以*時(shí)間確定支原體污染情況，顯著降低或避免支原體污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的影響。

二、支原體污染去除

1.     支原體污染預(yù)防

根據(jù)可能的支原體污染來(lái)源，在體外細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，要嚴(yán)格控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)器材、耗材要保證無(wú)菌；在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素；發(fā)現(xiàn)支原體污染后，要清除支原體，防微杜漸。

2.     支原體污染的去除及預(yù)防

因?yàn)橹гw沒(méi)有細(xì)胞壁，一般用于細(xì)胞壁合成的抗生素對(duì)支原體沒(méi)有作用，如青霉素、萬(wàn)古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍沒(méi)什么效果。對(duì)支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時(shí)，這些抗生素不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較小。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯能結(jié)合30S和50S核糖體亞基，從而抑制支原體蛋白質(zhì)合成，喹諾酮抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶。因此可以在細(xì)菌DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成兩個(gè)層面上抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，明顯增強(qiáng)除菌效果。

3.      支原體去除試劑選擇

選擇支原體去除試劑需要注意幾個(gè)關(guān)鍵幾點(diǎn)： ①細(xì)胞毒性小，毒性大的試劑在去除支原體的同時(shí)，會(huì)殺死細(xì)胞；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑，去除多種支原體，以及細(xì)菌，真菌等； ③操作簡(jiǎn)便，沒(méi)有二次污染；要考慮操作使用是否方便，因?yàn)槿绻褂闷饋?lái)比較麻煩，首先是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，另外可能會(huì)帶來(lái)二次污染。目前市場(chǎng)上有多種支原體去除&預(yù)防試劑可選。包括李記生物的Quick Cell支原體預(yù)防/去除試劑，美國(guó)GenDEPOT公司的Cellmaxin，羅氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

 Quick Cell支原體預(yù)防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個(gè)層面去除支原體，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨(dú)或聯(lián)合使用兩種成分，分別或同時(shí)在蛋白或DNA層面去除支原體污染，細(xì)胞毒性更小。作用周期1-2周，支原體去除率大于92%。去除預(yù)防兼顧

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分，抑制支原體及細(xì)菌生長(zhǎng)，去除培養(yǎng)細(xì)胞中已感染的支原體。適用于多種培養(yǎng)細(xì)胞，無(wú)明顯副作用，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過(guò)的細(xì)胞不會(huì)重新感染支原體。BM-Cyclin需聯(lián)合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原體。不確定能否預(yù)防。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素，四環(huán)素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星，屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對(duì)BIOMYC-3敏感，需要根據(jù)支原體種類使用。處理周期2周，能去除90%的支原體。是否可以預(yù)防支原體目前還不能確定。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物，包含兩個(gè)針對(duì)支原體的有效成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制階段，對(duì)許多細(xì)菌和真核細(xì)胞則沒(méi)有影響。作用周期2周，去除效率未知。有兩個(gè)濃度包裝，去除用高濃度，預(yù)防用低濃度。