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還在為如何提取完整的外泌體發(fā)愁嗎?
閱讀:2399 發(fā)布時間:2022-4-14在過去的幾十年中,外泌體因其在改變細胞功能中的作用而受到了廣泛關(guān)注。外泌體是膜結(jié)合的納米級囊泡,最初通過晚期核內(nèi)體的內(nèi)陷形成為特定的腔內(nèi)囊泡群。由于晚期多泡內(nèi)體與質(zhì)膜融合,這些內(nèi)體來源的腔內(nèi)囊泡隨后被釋放到細胞外環(huán)境中,這是一種將它們與其他類型的細胞外囊泡區(qū)分開來的生物發(fā)生機制[1]。
因此,外泌體外膜由富含供體細胞膜衍生蛋白的磷脂雙層和繼承細胞質(zhì)生物分子(包括蛋白質(zhì)、酶、mRNA、miRNA 和代謝物)的水內(nèi)核組成。外泌體的大小在 20-120 nm 之間,并且在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上因親代細胞而異[2]。外泌體亞群呈現(xiàn)出不同的形狀,從球形到絲狀和細長形,還可以包括不同的子隔室[3]。
外泌體結(jié)構(gòu)及形成過程
目前,已經(jīng)開發(fā)了多種分離策略來從各種生物來源中離外泌體,這些生物來源包括牛奶、血液和尿液,以及植物衍生產(chǎn)品,例如水果和蔬菜。
外泌體利用多種內(nèi)吞機制進入細胞。有趣的是,外泌體還可以克服物種障礙,在不同來源的細胞之間傳遞生物分子[4]。外泌體介導(dǎo)生物功能,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)重要的生理和病理過程[5]
外泌體生物學(xué)功能
由于外泌體是內(nèi)源性具有生物活性的生物分子的天然載體,它們已被廣泛用于主動和被動傳遞合成生物分子。它們的內(nèi)源性和納米特性也使這些納米載體能夠跨越生物屏障,并賦予它們優(yōu)良的生物相容性[6]。
因此,這幾年各領(lǐng)域廣泛展開外泌體相關(guān)的研究,外泌體研究橫跨幾乎所有的研究領(lǐng)域(免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、內(nèi)分泌、循環(huán)系統(tǒng)等)。
然而,目前用于外泌體研究的實驗技術(shù)仍處于開發(fā)階段,許多問題仍有待改進。例如,外泌體純化方法中,超速離心法和聚合物沉淀法(市售試劑盒)提取的外泌體中混有多種雜質(zhì),會給后續(xù)實驗造成許多障礙。而抗體親和法和密度梯度離心法這兩種提取方法的問題在于,雖然可以提取到高純度的外泌體,但外泌體結(jié)構(gòu)不完整,無法用于分析外泌體的生理功能。
磷脂酰絲氨酸和Tim4新型外泌體提取法
外泌體膜雖然含有分泌細胞源蛋白質(zhì)和脂質(zhì),但目前普遍認為在活細胞中磷脂酰絲氨酸(PS)通過脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶作用定位于細胞膜內(nèi)側(cè)[7]。
作為通過巨噬細胞進行細胞凋亡的吞噬受體(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4,Tim4)蛋白通過細胞外域IgV域與結(jié)合了鈣離子的PS結(jié)合[8]。
利用這一原理,Wako和金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)系免疫學(xué)華山教授共同開發(fā)一款劃時代的外泌體提取方法,利用Tim4固化磁珠,在鈣離子存在下捕捉培養(yǎng)上清和血清等樣品中的外泌體,再添加螯合劑從而提取外泌體[9]。并且MagCapture™外泌體提取試劑盒PS實現(xiàn)了比傳統(tǒng)的外泌體純化法更加簡單地提取高純度完整狀態(tài)的外泌體。
這是迄今為止取代黃金標準超速離心法的新型外泌體純化法。
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS
巨噬細胞表面的Tim4蛋白特異性結(jié)合細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸(PS)。
利用Tim4固化磁珠,在Ca2+ 存在條件下捕捉培養(yǎng)上清或血清等樣本中的外泌體,通過使用含有EDTA的洗脫液洗脫,可獲得高純度的完整細胞外囊泡(EVs)。
01
原理
02
特點
● 可獲得高純度完整細胞外囊泡,可用于蛋白及核酸分析、共培養(yǎng)及體內(nèi)注射
● 回收率高
● 操作簡便(3.5h),不需超速離心
03
應(yīng)用實例
外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)分析
通過MASS鑒定結(jié)果比較豐度最高的前 shi 種蛋白。
樣品:K562細胞培養(yǎng)上清(含10%去外泌體FBS)
白色柱:源自外囊泡的人類蛋白
灰色柱:來自FBS的牛蛋白污染物
綠色:來自外囊泡的標記蛋白
[9] Nakai Wataru.et al. (2016). A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci Rep, 6, 33935.