近咱們技術(shù)部門的小姐姐接到好多用戶朋友的詢問(wèn)，說(shuō)“不了解正在研究的蛋白用哪個(gè)抗體合適”。

也有用戶朋友經(jīng)常詢問(wèn)“說(shuō)明書中寫著可以用于ICC/IF，那我做組織的熒光成像是可以的吧？”

其實(shí)在選擇正確抗體的道路上，存在很多“坑”，只要成功避開，就可以選到適合您實(shí)驗(yàn)的抗體。

今天就來(lái)和大家分享一下“如何選擇正確的抗體”。

1、蛋白的名稱和亞型

咱們銷售員經(jīng)常拿到一些“似是而非”的英文名稱或簡(jiǎn)稱，查的時(shí)候不確定推薦的是否就是用戶要檢測(cè)的靶標(biāo)。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，建議大家參考SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，每個(gè)abcam說(shuō)明書的 “數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接”部分，有針對(duì)不同種屬的基因和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接， 其中顯示SwissProt的就是該蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接，點(diǎn)擊進(jìn)去后，在頁(yè)面的左邊有篩選框，可以點(diǎn)擊您感興趣的部分查看。

 

點(diǎn)擊Names&Taxonomy部分，可以看到該靶標(biāo)的基因名稱和蛋白名稱，以及替代名稱，也就是所謂的“小名”，看下您提供的名稱是否可以對(duì)應(yīng)上，如此判斷該抗體是否適合。

 

另外，關(guān)于蛋白亞型問(wèn)題，在這里也可以找到答案，點(diǎn)擊Sequences部分，可以看到該蛋白有幾個(gè)亞型，每個(gè)亞型的具體氨基酸序列和分子量大小，如果您正好做WB實(shí)驗(yàn)，就可以預(yù)估您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即可能檢測(cè)到的條帶位置。

 

不能不說(shuō)，SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)在太強(qiáng)大了，咱們用戶常常問(wèn)到的亞細(xì)胞定位-Subcellular location，翻譯后修飾-PTM/Processing部分，具體的修飾位點(diǎn)和修飾基團(tuán)等，都可以一一查看到。

2、抗體的應(yīng)用范圍

常見(jiàn)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，在abcam的說(shuō)明書中，主要包括如下幾種應(yīng)用：WB, IHC-P,IHC-Fr,IHC-FrFl,IHC-Wmt,IHC-FoFr,ICC,ICC/IF,IP,ChIP,ChIP/Chip,ELISA,EM,Flow Cyt等等，相信大家看到這些英文單詞也會(huì)一頭霧水吧，單單一個(gè)免疫組化-IHC，就可以細(xì)分這么多操作方式，而且在不同的品牌，不同英文單詞代表的含義還不盡相同，建議大家在選購(gòu)前，詢問(wèn)清楚不同品牌對(duì)應(yīng)的定義和質(zhì)保范圍。

如在abcam產(chǎn)品說(shuō)明書中，IHC-P即免疫組化石蠟切片，且實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證時(shí)，是搭配酶標(biāo)二抗，用DAB顯色的方式檢測(cè)的；IHC-FR即免疫組化冰凍切片，內(nèi)部驗(yàn)證時(shí)，是搭配熒光二抗，用熒光成像的方式檢測(cè)的；IHC-FoFr是冰凍灌注切片；IHC-FrFI是冰凍切片漂片；ICC/IF或ICC都是特指細(xì)胞水平的熒光成像，值得注意的是，這里ICC/IF里的IF，很多人會(huì)誤認(rèn)為既包括組織也包括細(xì)胞的熒光成像，導(dǎo)致選錯(cuò)抗體，做不出結(jié)果。

3、抗體能識(shí)別的樣本種屬

常見(jiàn)的檢測(cè)種屬，經(jīng)常如下描述：Reactivity：Human, Mouse, Rat, Sheep, Rabbit, Chicken, Hamster, Cat, Dog, Carp, African green monkey, Opossum, Chinese hamster, Common marmoset, Meriones unguiculatus.

有時(shí)還會(huì)見(jiàn)到如下描述：predicted: Cow, Pig, Mammals。

請(qǐng)大家務(wù)必注意：在abcam的說(shuō)明書里，Reactivity后面列到的種屬是可以質(zhì)保的，而predicted列到的種屬則是根據(jù)該蛋白在不同物種中的同源性比對(duì)數(shù)值，做出的推測(cè)。推測(cè)的種屬并沒(méi)有經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，是不能質(zhì)保的，僅供參考。

4、抗體的動(dòng)物來(lái)源

抗體的動(dòng)物來(lái)源即抗體的宿主物種，常見(jiàn)的有Rabbit，Mouse，Rat，Chicken，Goat，Sheep等，當(dāng)您選購(gòu)抗體時(shí)，建議盡量選和檢測(cè)樣本種屬不同的宿主物種，即您檢測(cè)mouse，盡量選擇非mouse來(lái)源的抗體，可以選rabbit來(lái)源的抗體。

5、制備抗體的免疫原

在說(shuō)明書中的免疫原，即Immunogen 部分，經(jīng)常如下描述，Synthetic peptide within Human X aa 200-250. The exact sequence is proprietary.或者Recombinant full length protein corresponding to X（這里的X指的是蛋白的名稱）.建議您根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，去選擇合適的抗體，如果您沒(méi)有特殊實(shí)驗(yàn)要求，那么全長(zhǎng)的免疫原序列是不錯(cuò)的選擇。

5、單克隆抗體和多克隆抗體

經(jīng)常有用戶問(wèn)到，單克隆還是多克隆抗體好？其實(shí)在回答這個(gè)問(wèn)題前，我們要先解釋下這兩者的含義，簡(jiǎn)單來(lái)講，單克隆抗體只能識(shí)別抗原的特定抗原表位，而多克隆抗體可以識(shí)別抗原的多個(gè)抗原表位，所以，單克隆抗體特異性高而靈敏度相對(duì)低一些，多克隆靈敏度高而特異性低一些，在不同實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，可以根據(jù)如下表格有側(cè)重選擇。

 

 

	單克隆抗體	多克隆抗體
特異性	++	+
批間差	++	+
靈敏度	+	++
WB	+	++
IHC	+	++
ICC	++	+
FlowCyt	++	+

 

7、抗體的克隆號(hào)

克隆號(hào)是給單克隆雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的編號(hào)。每個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生單個(gè)純同質(zhì)型抗體?？寺√?hào)相同的抗體代表制備抗體時(shí)的免疫原序列是相同的。

8、抗體的偶聯(lián)物

常見(jiàn)的偶聯(lián)物有酶、熒光素、生物素等，常見(jiàn)的酶有辣根過(guò)氧化物酶-HRP、堿性磷酸酶-AP等，常見(jiàn)的熒光素有傳統(tǒng)熒光素FITC、APC、Pe、Pe-cy3、Pe-cy5等，新型熒光素包括Alexa Fluor® 系列和DyLight® 系列各波長(zhǎng)的熒光素，一般做多重免疫染色時(shí)，會(huì)考慮選擇直接標(biāo)記熒光素的一抗，建議您先核實(shí)實(shí)驗(yàn)室儀器的熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的配置，選擇匹配儀器的激發(fā)波長(zhǎng)或通道的熒光抗體，盡量避免光譜重疊。

如果您需要尋找雙標(biāo)記和三標(biāo)記免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)組合，我們推薦如下：

免疫染色	抗體組合
雙色	Alexa Fluor® 488和Alexa Fluor® 647
三色	Alexa Fluor® 405、Alexa Fluor® 555和Alexa Fluor® 647

 

9、抗體驗(yàn)證

這里我們重點(diǎn)說(shuō)下目前有說(shuō)服力的基因敲除驗(yàn)證，即KO驗(yàn)證，該方法使用單倍體細(xì)胞模型的 CRISPR/Cas9 KO 人類細(xì)胞系。敲除模型是真正意義上的陰性對(duì)照，是抗體驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)品。

基因敲除模型通過(guò)觀察基因功能缺失的表型來(lái)了解特定基因的功能，這正是該模型的強(qiáng)大之處。目前，abcam有超過(guò)1600種的經(jīng)過(guò)敲除驗(yàn)證的抗體，過(guò)去的一年中，還將 200 多種非特異性抗體從abcam的產(chǎn)品目錄中移除。當(dāng)然敲除驗(yàn)證僅是為提高抗體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所采取的眾多步驟之一。

以上就是在抗體選擇道路上常常遇到的問(wèn)題，希望對(duì)大家有所幫助。廣州東銳科技有限公司和廣州新晉生物科技有限公司作為abcam在華南區(qū)的一級(jí)授權(quán)代理商，為您的科研保駕護(hù)航，幫助您更快地達(dá)成科研使命。