#本文由馬爾文帕納科醫(yī)藥業(yè)務發(fā)展經理 韓佩韋博士供稿#

蛋白質的熱穩(wěn)定性研究對于加深對蛋白質的結構和功能的了解有著非常重要的意義。差示掃描量熱技術（DSC）是直接測量熱轉變過程焓變（ΔH）的分析方法，例如蛋白質，核酸或其他生物多聚物的熱變性過程，為表征蛋白質及其他生物分子的熱穩(wěn)定性建立“金標準”技術。

一、焓變對于蛋白質的穩(wěn)定性意味著什么？

1，什么是焓（hán）變（ΔH）？

ΔH（焓變）是在恒壓狀態(tài)下將系統(tǒng)升高至溫度T過程中攝取的總能量。對于蛋白質而言，這意味著用于使蛋白質發(fā)生去折疊所花費的能量（熱量），此過程中 ΔH 是為正值，代表這是一個吸熱過程。這種能量與蛋白質中所有原子和分子運動相關，以及維系蛋白質保持折疊構象中的鍵能。

通過將吸熱譜圖下方的面積進行積分（見圖 1）可以計算得到焓變（ΔH）。焓變用每摩爾蛋白質的吸收的卡路里（或焦耳）來表示。由于蛋白質在 DSC 實驗中暴露于升高的溫度，因此蛋白質開始發(fā)生熱變性，并伴隨著非共價鍵的斷裂。焓變（ΔH）與維系蛋白質天然（折疊）構象中所需的價鍵數(shù)量有關。焓變（ΔH）也取決于我們測量總蛋白質濃度的準確程度。如果蛋白質濃度不是很準確, 則會影響到計算出的ΔH值。

2，焓變（ΔH）值可以在實踐中告訴我們什么？

當您比較不同蛋白質的DSC結果時，具有較大ΔH值的蛋白質不一定比具有較小ΔH的蛋白質更穩(wěn)定。由于ΔH值會對蛋白質摩爾濃度歸一化，因此該值通常與蛋白質的尺寸成比例。大多數(shù)蛋白質具有相同的鍵密度（單位體積內的價鍵數(shù)量），因此，期待具有較大分子量的蛋白質也具有較大的焓變（ΔH）值也是合理的。

3，焓變（ΔH）的決定因素是什么？

焓變（ΔH）取決于溶液中天然蛋白質的百分比。

一個非常重要的考慮是DSC僅測量初始處于折疊（天然）構象中的蛋白質的ΔH值。ΔH值取決于具有折疊（活性）構象的濃度。如果初始折疊蛋白質組分小于總蛋白質濃度（即活性濃度小于100％），則計算出的ΔH值將相應地變小。

下圖顯示了在儲存期間的不同時間測量的相同蛋白質的DSC圖譜。藍色曲線圖譜表示新鮮制備的蛋白質，是100％天然（折疊）蛋白質。當?shù)鞍踪|樣品在儲存期間發(fā)生部分變性時，溶液中的天然蛋白質的比例開始下降，導致DSC圖譜的焓變降低。當我們擁有100％天然蛋白質的參考DSC圖譜時，我們可以根據(jù)不同狀態(tài)樣品的相對ΔH值來估計每個樣品中的折疊蛋白質比例。

4，如何判斷蛋白質是否失活？

到目前為止，我們已提及的焓變是指通過DSC儀器直接測量到的“熱”焓，也就是熱力學焓變，通常表示為ΔH_cal，這是其他任何非量熱技術，例如圓二色譜（CD），表面等離子共振（SPR）等技術不能獲取的焓變量。

還有另一種其他技術可以獲取的焓變類型，即范霍夫焓變 - ΔH_VH，我們同樣可以通過DSC數(shù)據(jù)計算得出。范霍夫焓變（ΔH_VH）可從通過DSC非兩狀態(tài)模型（non-2-state model）擬合得到。

兩種不同的焓變對蛋白質熱穩(wěn)定性的測定又有什么實際意義呢？

在DSC技術中，ΔH_cal僅由DSC熱轉變峰曲線積分的面積來確定，而ΔH_VH僅通過熱轉變峰曲線的形狀來確定。轉變峰形越尖銳，ΔH_VH越大，反之亦然。ΔH_cal是具有濃度依賴性的，但ΔH_VH不是。

若ΔH_cal/ΔH_VH比例為1，通常意味著所研究的熱轉變狀態(tài)符合兩狀態(tài)去折疊（Two-state unfolding model）模型。如果ΔH_cal/ΔH_VH比例大于1，則意味著存在顯著密集的中間體存在;  而ΔH_cal/ΔH_VH比小于1，則意味著存在分子間相互作用。

使用ΔH_cal/ΔH_VH可以幫我們估測是否有很大部分蛋白質是失活的。如果我們有一個簡單的單結構域蛋白質，并且假定沒有中間體，則我們可以預測，其去折疊過程的ΔH_cal/ΔH_VH的比值不會遠離1。因此，如果ΔH_cal顯著低于ΔH_VH，可以表明很大部分蛋白質已經失活。

綜上所述，對DSC中ΔH數(shù)據(jù)的分析可以讓我們了解蛋白質的去折疊機制，以及多少蛋白質處于其活性的天然構象。

二、TM值如何與和蛋白質穩(wěn)定性相關？

中點轉變溫度T_M

我們可以從DSC數(shù)據(jù)中提取多個熱力學參數(shù)，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓變），ΔCP和ΔG，但*泛使用的參數(shù)是T_M。順便提一下，這也是最容易和最準確的值 - T_M是最大峰值所對應的溫度。

 “蛋白質穩(wěn)定性”有多種定義。最常見的是，對于工業(yè)上有重要意義的蛋白質，該術語是指在生理溫度下的功能（或操作）穩(wěn)定性; 即，他們可以在37°C下發(fā)揮多長時間的生物功能？這可以通過需要花幾天或數(shù)周時間的等溫研究來評估，或者，如果使用差示掃描量熱法（DSC），則可以在幾分鐘內變性蛋白質。

通過DSC獲得的哪個熱力學參數(shù)與功能穩(wěn)定性相關度最佳？事實證明，是T_M值。

熱力學穩(wěn)定性（ΔG）是功能穩(wěn)定性的較差的預測因子; 技術上，ΔG僅適用于可逆去折疊過程，此外，它由T_M，ΔH和ΔCP計算得到，后者可能很難獲取。

一個例子是T_M和ΔG與肉桿菌蛋白抗原血清型C的半數(shù)聚集時間(half time)（作為功能穩(wěn)定性的量度）的相關性，用作模型蛋白。ΔG與T_{1 / 2 agg.} 相關系數(shù)（R）僅為0.4，而T_M 與 T_{1 / 2 agg.}的相關系數(shù)是0.92。（來自J Pharm Sci的數(shù)據(jù)，2011 Mar; 100（3）：836-48）

思考T_M的一種方式：

如下圖所示，假設我們用 DSC 掃描兩種不同配方中的蛋白質或兩種不同的蛋白質構建體，則 T_M 值向低溫方向 5℃ 的負偏移（穩(wěn)定性下降）實際上反映了在 37℃ 條件下的 Fu （蛋白去折疊比例）由2％增加到 3％。溫度 T 下的 Fu 蛋白可以通過圖像化的方式估算，即溫度 T 以下的曲線下陰影區(qū)域面積和整個曲線下方面積的百分比。

由于聚集體的生成可能是濃度依賴的過程，因此較高濃度的去折疊蛋白質（紅色掃描曲線）將導致較快的聚合（更大組分的去折疊狀態(tài)（U）才能轉換為不可逆變性狀態(tài)（I）。參見下面的原理圖。

這種解析的一個推論是，曲線的整體形狀應該是相似的。我們假定這種情況是對于在不同配方中的相同蛋白質或由一個母分子衍生出來的具有相似構建體的蛋白質。但是，對于*不同的蛋白質，使用T_M值作為用于穩(wěn)定性比較的預測指標則應該謹慎使用。

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Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpractice

Differential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and Power

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