核心摘要  
在精確腫瘤學(xué)中，預(yù)測(cè)臨床相關(guān)腫瘤行為（如治療反應(yīng)和耐藥性的出現(xiàn)）有兩種主要策略：基于患者樣本的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)和/或蛋白質(zhì)組學(xué)分析的推斷，以及個(gè)性化癌癥化身的表型分析。一直以來，我們依賴于體內(nèi)小鼠異種移植和體外類器官或2D細(xì)胞培養(yǎng)。
快速組合遺傳模型的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，一種用先天免疫低下的斑馬魚研究人類腫瘤異種移植的新技術(shù)開發(fā)，以及*利用斑馬魚幼魚異種移植進(jìn)行藥物反應(yīng)表型檢測(cè)的臨床試驗(yàn)，使這種微小的脊椎動(dòng)物走到了研究的前沿精準(zhǔn)醫(yī)療競(jìng)技場(chǎng)。在這篇綜述中，討論了轉(zhuǎn)基因和基于移植的斑馬魚癌癥化身的進(jìn)展。
文｜Maurizio Fazio , Julien Ablain, Yan Chuan, David M. Langenau  and Leonard I. Zon
翻譯丨張偉浩
文章原標(biāo)題：《Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy》
發(fā)表于《Nature Reviews |CANCER》volume 20 | May 2020 | 263
（本文在翻譯中做了部分節(jié)選）
【圖1】
一、綜述
生物醫(yī)學(xué)界一直在開發(fā)越來越多的新型抗癌藥物。在化療是可獲得的系統(tǒng)性治療的時(shí)代結(jié)束后，一系列新的靶向治療以及免疫治療藥物進(jìn)入了臨床開發(fā)或獲得了監(jiān)管批準(zhǔn)。不斷擴(kuò)大的治療方案為需要系統(tǒng)治療的癌癥患者帶來了新希望，但也給腫瘤醫(yī)生帶來了新的挑戰(zhàn)。給特定的病人開哪種藥這個(gè)看似簡(jiǎn)單的問題越來越難以確定地解決。新藥物的開發(fā)速度超過了需要進(jìn)行的長(zhǎng)期和復(fù)雜的試驗(yàn)，以確定哪種劑量、時(shí)間表和組合策略將為特定的患者群體帶來臨床效益。
精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域誕生于解決這些問題的需要，即創(chuàng)建一種新的預(yù)后和治療范式，專注于對(duì)單個(gè)患者(而非群體)進(jìn)行優(yōu)化治療。從哲學(xué)上講，精準(zhǔn)醫(yī)療遠(yuǎn)離了基于群體平均水平比較的預(yù)測(cè)，而是關(guān)注患者*的疾病特征。
具體來說，在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中，這種新范式產(chǎn)生了兩種主要方法：

其一種方法是基于對(duì)腫瘤活檢樣本的單個(gè)或多個(gè)組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）分析來推斷疾病行為，由于技術(shù)的改進(jìn)，這種方法相對(duì)快速且廉價(jià)；第二種方法是利用從體外培養(yǎng)或異種移植的腫瘤活檢樣本中獲得的個(gè)性化癌癥化身，對(duì)腫瘤行為和藥物反應(yīng)進(jìn)行功能測(cè)試。
作為一種臨床預(yù)測(cè)工具，前一種方法受到以下因素的限制：我們對(duì)常見癌癥驅(qū)動(dòng)因素之外的基因中單個(gè)基因突變的功能后果的了解、事件組合的影響以及克隆動(dòng)力學(xué)和腫瘤進(jìn)化的復(fù)雜性，這些因素可能導(dǎo)致藥物反應(yīng)。
后一種方法通過模擬聚焦于腫瘤的表型行為和模擬可能的治療設(shè)置來克服這種復(fù)雜性;然而，它受到特定模型的生物學(xué)保真度的限制，作為病人反應(yīng)的代理，以及后勤方面的考慮——分析時(shí)間、成本和可伸縮性，以及測(cè)試多種條件的挑戰(zhàn)。
藥物反應(yīng)的表型測(cè)試歷來依賴于在體外培養(yǎng)的患者來源的癌細(xì)胞，如2D培養(yǎng)或3D類器官，或在體內(nèi)培養(yǎng)的小鼠異種移植。轉(zhuǎn)基因斑馬魚和移植斑馬魚癌癥化身技術(shù)進(jìn)展，加上規(guī)模、成本、時(shí)間和條件的多重性等內(nèi)在的物流優(yōu)勢(shì)，自動(dòng)化的潛力將斑馬魚帶入精確癌癥治療藥物反應(yīng)的表型測(cè)試領(lǐng)域。
在這篇綜述中，我們重點(diǎn)介紹了工具的歷史和進(jìn)化，這些工具使得在斑馬魚中快速生成組合轉(zhuǎn)基因癌癥模型成為可能，以及37°C飼養(yǎng)的免疫缺陷斑馬魚的幼魚和成體標(biāo)本異種移植的發(fā)展。
二、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因癌癥模型：
由于與人類廣泛保存器官特異性遺傳程序和癌癥相關(guān)基因，端粒生物學(xué)上與人類比小鼠更為相似，并且在單細(xì)胞階段通過顯微注射對(duì)胚胎進(jìn)行基因操作相對(duì)容易，斑馬魚很快成為一種有希望在體內(nèi)模擬癌癥的生物體。
圖1如下：
【圖2】
2003年，*報(bào)道了斑馬魚T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T- ALL)基因工程癌癥模型（圖1）。將小鼠Myc非保守片段置于斑馬魚rag2啟動(dòng)子的控制下，該啟動(dòng)子限制對(duì)淋巴細(xì)胞的表達(dá)。當(dāng)將其注射到野生型斑馬魚胚胎中時(shí)，5%的F0斑馬魚在1個(gè)月到5個(gè)月大之間發(fā)育出T-ALL。轉(zhuǎn)基因的種系傳遞使外顯率提高到100%，降低了腫瘤的潛伏期。
這個(gè)模型為斑馬魚的癌癥建模提供了一個(gè)顯著的概念證明，并為白血病發(fā)生機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。這項(xiàng)研究也為在斑馬魚身上開發(fā)其他腫瘤模型鋪平了道路，包括2004年的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和2005年的黑色素瘤，從那時(shí)起，已經(jīng)建立了許多其他的模型，包括使用Cre介導(dǎo)的重組的條件模型和化學(xué)誘導(dǎo)模型。
然而，在大多數(shù)人類癌癥，特別是實(shí)體腫瘤中，腫瘤發(fā)生被認(rèn)為需要多種基因驅(qū)動(dòng)，包括致癌基因的激活和腫瘤抑制因子的缺失。因此，除了RAS驅(qū)動(dòng)的模型外，僅基于致癌基因表達(dá)的斑馬魚模型普遍表現(xiàn)出較低的外顯率，這在很大程度上限制了它們的使用。其他局限性包括許多模型是通過一種致癌基因的表達(dá)偶然獲得的，而這種致癌基因并不總是反映人類腫瘤的早期克隆基因驅(qū)動(dòng)因素。驅(qū)動(dòng)癌基因表達(dá)的啟動(dòng)子的組織特異性的程度對(duì)于人類腫瘤發(fā)生的忠實(shí)再現(xiàn)也是至關(guān)重要的。
斑馬魚黑色素瘤模型使用了人類黑色素瘤中常見的驅(qū)動(dòng)因子BRAFV600E，放置在黑色素細(xì)胞特異性斑馬魚mitfa啟動(dòng)子的控制下。
與人類一樣，BRAF V600E在斑馬魚黑色素細(xì)胞中的表達(dá)只產(chǎn)生豬色素痣。然而，在斑馬魚體內(nèi)注射攜帶tp53腫瘤抑制基因33失活突變的mitfa:BRAFV600E構(gòu)建體（其人類同源基因在約15%的人類黑色素瘤中發(fā)生突變）在4個(gè)月內(nèi)啟動(dòng)了6%斑馬魚惡性黑色素瘤的形成。這些腫瘤經(jīng)組織學(xué)和表型分析證實(shí)為黑色素瘤。
重要的是，該病的外顯率在穩(wěn)定期達(dá)到近100%mitfa:BRAF V600E；tp53−F1轉(zhuǎn)基因斑馬魚。這個(gè)mitfa:BRAF V600E；tp53−斑馬魚黑色素瘤模型隨后成為多基因篩選的可靠基礎(chǔ)，旨在在體內(nèi)功能性探測(cè)人類黑色素瘤遺傳學(xué)，并已鑒定出幾種新的黑色素瘤調(diào)節(jié)劑。
雖然這種建模方法非常有價(jià)值，但也存在一些技術(shù)上的困難。首先，就像其他成熟的轉(zhuǎn)基因斑馬魚癌癥模型一樣，維持含有多個(gè)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定細(xì)胞系是困難的；其次，可以組合的轉(zhuǎn)基因數(shù)量仍然有限，這使得測(cè)試復(fù)雜的遺傳相互作用具有挑戰(zhàn)性。第三，與人類癌基因的過表達(dá)不同，內(nèi)源性斑馬魚腫瘤抑制基因的敲除是系統(tǒng)性的，而不是組織特異性的。大多數(shù)模型仍然是基于人類致癌基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而不是內(nèi)源性或同源斑馬魚位點(diǎn)的敲入，因此可能沒有生sl理水平的表達(dá)?；蚪M編輯技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)并將有助于克服這些限制。
三、快速組合遺傳建模：
CRISPR–Cas9系統(tǒng)為體內(nèi)癌癥建模創(chuàng)造了新的機(jī)會(huì)。它允許腫瘤抑制基因的快速鑲嵌失活，繞過穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因系的需要。它還通過靶向不同基因的導(dǎo)向rna（gRNAs）的多重化大大增加了組合建模的潛力，使得對(duì)復(fù)雜的人類癌癥基因型的重述和從人類癌癥基因組學(xué)推斷的假定遺傳相互作用的體內(nèi)評(píng)價(jià)成為可能。它促進(jìn)了大規(guī)模的屏幕識(shí)別新的癌癥驅(qū)動(dòng)因素的目標(biāo)。
  在老鼠身上，CRISPR使快速建立敲除斑馬魚系成為可能。利用Tol2轉(zhuǎn)座子技術(shù)，該技術(shù)有助于將DNA結(jié)構(gòu)插入斑馬魚基因組，CRISPR載體已被開發(fā)用于組織特異性基因失活，其方法是將斑馬魚U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gRNA盒與置于組織限制性斑馬魚啟動(dòng)子控制下的cas9序列組裝在一起。在胚胎組織如肌肉和紅細(xì)胞中觀察到有效的鑲嵌基因敲除。
通過設(shè)計(jì)靶向斑馬魚腫瘤抑制基因的載體，并以黑素細(xì)胞特異性的方式表達(dá)人類腫瘤基因，我們能夠通過將BRAF、NRAS或KIT中的致癌突變與cdkn2a、tp53、ptena或ptenb中的功能缺失突變相結(jié)合，快速而有力地模擬人類黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的所有主要基因型（圖2）. 侵襲性基因型的腫瘤在注射后3周(NRAS Q61R表達(dá)和tp53缺失)或在幾個(gè)月內(nèi)(BRAF V600E表達(dá)和cdkn2a缺失)就得到了，這與在人類疾病中的觀察結(jié)果一致。
圖2如下：
【3】
四、斑馬魚腫瘤異種移植：
斑馬魚作為移植接受者，斑馬魚有許多固有的特征使它成為理想的移植接受者。
首先，通過熒光標(biāo)記移植細(xì)胞，可以很容易地追蹤移植的正?；驉盒约?xì)胞，并且使用光學(xué)透明的casper斑馬魚品系作為受體，可以直接觀察移植物。
第二,斑馬魚是高度多產(chǎn)的,成熟的雌性每周能產(chǎn)生數(shù)以百計(jì)的雞蛋,但是很小,所以成千上萬的斑馬魚可以保存在一個(gè)設(shè)施,因此管理和維護(hù)成本相對(duì)較低的老鼠(雖然這可能國(guó)家和機(jī)構(gòu)之間的顯著差異,據(jù)報(bào)道,比率是數(shù)量級(jí)的成本約1.05美元每只老鼠和大約0.01美元每成年斑馬魚). 重要的是,可以在執(zhí)行手動(dòng)移植或顯微鏡下注射幾百成年斑馬魚或者幾千斑馬魚魚仔,分別在一天內(nèi)由一個(gè)操作符(圖2 b),促進(jìn)大——規(guī)模和高吞吐量細(xì)胞移植研究與免疫力低下小鼠模型是很難執(zhí)行的。將非免疫匹配的斑馬魚細(xì)胞移植到部分免疫受損的成年斑馬魚體內(nèi)已經(jīng)成為常規(guī)。當(dāng)與斑馬魚模型中可用的大規(guī)模遺傳篩選和藥物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)相結(jié)合時(shí)，這些研究為腫瘤內(nèi)克隆進(jìn)化和異質(zhì)性、治療耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移、造血和干細(xì)胞移植提供了有價(jià)值的見解。
（1）斑馬魚幼魚的異種移植：
2006年至2007年，人們*描述了將人類癌細(xì)胞系異種移植到斑馬魚幼魚中的黑色素瘤。此后，大量研究報(bào)道了將癌細(xì)胞系異種移植到斑馬魚幼魚中。然而，尤其早期的研究并不總是包括對(duì)異種移植存活和增殖的嚴(yán)格評(píng)估。十年后，三項(xiàng)概念證明研究發(fā)表了，它們?cè)诎唏R魚幼魚中從血液惡性腫瘤和實(shí)體腫瘤中開發(fā)了患者來源的異種移植(PDXs)，隨后其他研究顯示了腫瘤細(xì)胞亞群之間的合作，可以協(xié)同促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和藥物反應(yīng)的表型測(cè)試。
斑馬魚的適應(yīng)性和先天免疫系統(tǒng)在小鼠和人類中高度保守。在斑馬魚中，先天免疫在受精后一天開始發(fā)育，而適應(yīng)性免疫在受精后2-3周左右在形態(tài)和功能上成熟。在早期幼體發(fā)育過程中，免疫缺陷期較短，這使異種移植的人類或小鼠細(xì)胞移植和短期存活，而不需要對(duì)斑馬魚進(jìn)行免疫。通過這種方法，多種類型的細(xì)胞被移植到斑馬魚體內(nèi)，得到了許多重要的發(fā)現(xiàn)，包括控制癌細(xì)胞分化、增殖和遷移的機(jī)制，以及治療反應(yīng)。一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是野生型斑馬魚幼體在形成色素沉著之前具有天然的光學(xué)清晰度，這使得移植細(xì)胞的單細(xì)胞分辨率成像、分析和量化變得容易，這一特性優(yōu)于其他移植模式生物。第三，大多數(shù)以幼魚為受體的異種移植實(shí)驗(yàn)是在37℃以下進(jìn)行的，在這些溫度下，移植的人體細(xì)胞不會(huì)以相同的速度增殖，也不會(huì)形成類似于免疫缺陷的腫瘤塊Nsg小鼠或人類患者。
 （2）成年斑馬魚的異種移植：
免疫缺陷斑馬魚模型是開發(fā)的移植異種患者來源的癌細(xì)胞到成年斑馬魚受體。以前在促進(jìn)異種移植細(xì)胞在成年斑馬魚體內(nèi)的長(zhǎng)期移植和存活方面的嘗試包括使用輻射或化學(xué)處理對(duì)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)進(jìn)行短暫的消融。
γ輻照野生型或casper受體斑馬魚魚允許穩(wěn)定的移植腫瘤和造血的細(xì)胞移植后20天,因?yàn)橐驗(yàn)檎丈浜?0天宿主免疫系統(tǒng)恢復(fù),但還沒有報(bào)道可能的人類細(xì)胞移植。類固醇藥物地塞米松的長(zhǎng)期化學(xué)誘導(dǎo)免疫抑制可使人體腫瘤的一部分移植時(shí)間超過時(shí)間點(diǎn)30天。由于地塞米松本身是臨床上用于白血病和淋巴瘤的抗癌藥物，這種方法不適合評(píng)估血液和白血病細(xì)胞移植。此外，化學(xué)免疫抑制引入了另一層實(shí)驗(yàn)變異性，并可能導(dǎo)致藥物與被測(cè)試劑的相互作用，可能混淆實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋，從而阻礙標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；?br />為了克服這些局限性，Langenau小組建立了一個(gè)成年斑馬魚異種移植模型，該模型允許，通過將prkdc（編碼DNA活化蛋白激酶催化亞單位）和il2rga（編碼白細(xì)胞介素2受體-γa）的純合失活突變導(dǎo)入透明casper斑馬魚體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)人和小鼠細(xì)胞的長(zhǎng)期植入和增殖。這些有免疫缺陷的斑馬魚是透明的，缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，并能在37°C存活。值得注意的是，在37℃飼養(yǎng)斑馬魚沒有發(fā)現(xiàn)任何缺陷，除了增加了飼養(yǎng)的工作量。生存能力高，斑馬魚對(duì)這種溫度的適應(yīng)時(shí)間很長(zhǎng)。
此外，經(jīng)過馴化的斑馬魚在超過28天的時(shí)間內(nèi)成功地移植了大量的人類癌細(xì)胞系和PDX。與幼魚移植試驗(yàn)相比，成魚移植試驗(yàn)的另一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，每只成年斑馬魚可使用的移植細(xì)胞數(shù)量顯著增加（每只斑馬魚可使用200萬個(gè)細(xì)胞），此外，還有實(shí)驗(yàn)窗口較長(zhǎng)和人體溫度的優(yōu)點(diǎn)。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞增殖和凋亡率與NSG小鼠體內(nèi)相同腫瘤的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞增殖和凋亡率相同?；谠谛∈竽Ｐ椭械慕?jīng)驗(yàn)，我們期望prkdc-/- il2rga-/-品系的進(jìn)一步工程可以克服當(dāng)前的限制，例如，由于魚類和人類細(xì)胞因子之間的有限保守性，或殘余適應(yīng)性免疫，并進(jìn)一步提高穩(wěn)定性和增加人類腫瘤的范圍移植。
 （3）斑馬魚的藥物測(cè)試：
用大量的斑馬魚移植患者的腫瘤或轉(zhuǎn)基因模型可以測(cè)試大量的臨床可用藥物，由于斑馬魚化身與臨床決策的配對(duì)反應(yīng)可以幫助對(duì)患者進(jìn)行分層，以獲得其腫瘤的治療(圖3)。斑馬魚虛擬化身的邏輯優(yōu)勢(shì)與其他體內(nèi)特定患者虛擬化身相比，顯著增加了藥物試驗(yàn)的可能規(guī)模(表1)。
表一如下：
【4】
（4）斑馬魚的用藥途徑：
治療斑馬魚的方法是將藥物直接加入水中，并將幼魚和成魚浸入水中。此外，成人可以通過腹腔注射給藥或口喂法（圖3）。通過浸沒療法將藥物輸送到幼魚體內(nèi)，使得無法準(zhǔn)確評(píng)估藥物劑量、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)（圖3）。
圖3如下：
【5】
相比之下，通過口服管飼或腹腔注射給藥的臨床相關(guān)藥物給藥可以更嚴(yán)格地控制給藥，也可以使用混合血漿樣品通過質(zhì)譜法評(píng)估藥代動(dòng)力學(xué)。此外，與浸沒不同的是，灌胃和腹腔注射可以有效輸送水溶性較低的小分子和抗體。人類、小鼠和斑馬魚之間的藥代動(dòng)力學(xué)差異是該領(lǐng)域一直面臨的一個(gè)重要問題，但實(shí)證測(cè)試已被有效地用于確定口服灌胃和藥浴治療的劑量轉(zhuǎn)換因子。
此外，口服化療藥物(替莫唑胺)和靶向治療(奧拉帕尼)對(duì)成年斑馬魚PDXs (zPDXs)產(chǎn)生的血液藥代動(dòng)力學(xué)特征與人類和小鼠非常相似。因此，雖然在每個(gè)病例的基礎(chǔ)上優(yōu)化藥物劑量是必要的，但有可靠的證據(jù)表明，藥物動(dòng)力學(xué)本身并不是斑馬魚化身的跨物種障礙。
 （5）臨床反應(yīng)測(cè)定：
患者對(duì)癌癥治療的臨床反應(yīng)是通過測(cè)量磁共振成像或計(jì)算機(jī)斷層掃描的成像數(shù)據(jù)的腫瘤直徑變化來確定的。根據(jù)大小變化，根據(jù)reCisT標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者的反應(yīng)進(jìn)行分類。在小鼠異種移植腫瘤中，卡尺，計(jì)算機(jī)斷層掃描或正電子發(fā)射斷層掃描，或熒光素酶生物發(fā)光通常用于腫瘤反應(yīng)測(cè)量。
在斑馬魚中，藥物反應(yīng)通過幾種方式進(jìn)行測(cè)量：（1）在未標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的透明受體中直接成像（特別是對(duì)于作為黑色素瘤的天然豬腫瘤），（2）腫瘤大小的熒光成像（通過用熒光蛋白病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)患者來源的細(xì)胞（例如，增強(qiáng)GFP），或用FUCCI4顯示細(xì)胞周期相，（3）通過將癌細(xì)胞暴露于活性熒光染料，或（4）非侵入性地使用超聲波。細(xì)胞數(shù)（幼魚zPDX）和腫瘤表面積（幼魚和成魚zPDX）已被用作使用RECIST標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤反應(yīng)測(cè)量。這些方法與斑馬魚平臺(tái)提供的高通量體內(nèi)篩選相結(jié)合，提供了更快的成像終點(diǎn)，利用實(shí)時(shí)評(píng)估藥物效應(yīng)的能力降低到單細(xì)胞分辨率。
  （6）可以測(cè)試的藥劑類型：
早期強(qiáng)調(diào)的化身模型和不同生物中的目標(biāo)保護(hù)之間的生物學(xué)差異，直接影響了哪種治療藥物可以被有效評(píng)估(如文中表1)。
許多抗癌藥物已成功應(yīng)用于斑馬魚，包括各種類型的化療，小分子抑制劑如達(dá)沙替尼和抗體療法如貝伐珠單抗和西妥昔單抗。例如，成人zPDX模型被用于鑒定多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑olap- arib和化療藥物替莫唑胺聯(lián)合治療橫紋肌肉瘤的有效性。聯(lián)合治療的療效在小鼠異種移植模型中得到了再現(xiàn)，進(jìn)一步證明了兩種受體生物模型在藥物測(cè)試中的等效性。
該藥物組合目前正進(jìn)入兒科橫紋肌肉瘤的臨床試驗(yàn)，并代表了從使用斑馬魚的異種移植臨床前研究開始的聯(lián)合治療的臨床試驗(yàn)。化療對(duì)斑馬魚和人類的靶點(diǎn)具有高度的保守性，而使用小分子或抗體的靶向治療則高度依賴靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)保守性來發(fā)揮作用。因此，通常只有在異種移植細(xì)胞移植模型中才能有效地評(píng)估癌細(xì)胞的內(nèi)在靶點(diǎn)。
另一方面，針對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）的靶向治療將根據(jù)確切的靶點(diǎn)保守性表現(xiàn)出更大程度的可行性。類似的考慮也適用于轉(zhuǎn)基因模型，在轉(zhuǎn)基因模型中，我們通常引入人類版本的驅(qū)動(dòng)癌基因，但針對(duì)其他基因或合成致死方法的治療是否成功取決于靶點(diǎn)的保護(hù)。與使用NSG小鼠的移植研究一樣，zPDX模型中缺乏患者特異性免疫腫瘤微環(huán)境和/或協(xié)同進(jìn)化，以及缺乏跨物種靶點(diǎn)保護(hù)（例如，PD1等免疫檢查點(diǎn)的有限序列保護(hù)，PDL1和CTLA4）對(duì)在斑馬魚化身中提供一個(gè)有效的代理進(jìn)行評(píng)估提出了挑戰(zhàn)患者對(duì)針對(duì)免疫TME的藥物的反應(yīng)。
另一個(gè)混雜因素，特別是在幼魚是潛在的毒性作用，許多抗癌藥物對(duì)斑馬魚受體幼魚本身，因?yàn)樗?jīng)歷了一個(gè)快速發(fā)展階段。事實(shí)上，觀察到的腫瘤縮小也可能是毒性對(duì)受體本身的間接影響的結(jié)果，這將損害其支持癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。
     （7）預(yù)測(cè)反應(yīng)和抵抗：
斑馬魚化身對(duì)精確癌癥治療的價(jià)值歸結(jié)為：（1）預(yù)測(cè)能力，（2）實(shí)驗(yàn)規(guī)模和（3）為臨床決策提供信息的分析持續(xù)時(shí)間。
因此，值得考慮斑馬魚化身在預(yù)測(cè)藥物敏感性和耐藥性方面的益處和局限性。耐藥性通常分為原發(fā)性或固有性耐藥性（當(dāng)患者對(duì)藥物無反應(yīng)時(shí)）和繼發(fā)性或獲得性耐藥性（當(dāng)患者對(duì)藥物敏感時(shí)產(chǎn)生耐藥性）。前者通常由腫瘤顯性克隆或TME的遺傳組成決定，而后者則被認(rèn)為是通過達(dá)爾文選擇較小的遺傳抗性的預(yù)先存在的克隆或轉(zhuǎn)錄拉馬克適應(yīng)，然后對(duì)一個(gè)性狀進(jìn)行遺傳固定而獲得的。
以斑馬魚為例，在BRAF或KIT驅(qū)動(dòng)的黑色素瘤背景下，通過spred1失活的快速組合轉(zhuǎn)基因模型，探討了斑馬魚的原代遺傳抗性。用靶向療法對(duì)成年轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行浸沒治療，以治療粘膜黑色素瘤患者，結(jié)果顯示這種普遍的功能喪失遺傳事件導(dǎo)致對(duì)抑制KIT酪氨酸激酶活性的藥物產(chǎn)生耐藥性（如文中圖3）。
機(jī)制研究進(jìn)一步表明，MEK和KIT抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的潛在療效。由于藥物暴露時(shí)間短確定主要抗性，幼魚和成蟲ZPDX都是很適合解決這個(gè)問題的模型。從腫瘤活檢標(biāo)本中提取的幼魚zPDXs與腫瘤類器官非常相似，在手術(shù)前的新輔助治療中可能特別有用，有助于快速選擇有效的化療方案。
另一方面，這樣一個(gè)短期的幼魚移植試驗(yàn)，每個(gè)受體的細(xì)胞數(shù)量有限，不太可能是一個(gè)很好的預(yù)測(cè)繼發(fā)性耐藥性。這在Fior等人的工作中很明顯。模擬多克隆腫瘤，移植前將兩個(gè)等基因細(xì)胞系（含突變KRAS的HCT116細(xì)胞和含野生型KRAS的Hke3細(xì)胞）按1:1混合，每個(gè)細(xì)胞用不同的熒光顏色標(biāo)記。雖然多克隆腫瘤暴露于葉酸-5-氟尿嘧啶-奧沙利鉑（FOLFOX）化療方案導(dǎo)致腫瘤整體縮小，但Hke3耐藥克隆的大小沒有改變。
因此，如果沒有不同的顏色標(biāo)記，即使一個(gè)非常大的亞克隆沒有反應(yīng)，一個(gè)實(shí)際的腫瘤也會(huì)被認(rèn)為是敏感的。我們有理由推測(cè)，較長(zhǎng)的時(shí)間窗口和較大數(shù)量的成體zPDXs細(xì)胞將更好地定位這些模型，以預(yù)測(cè)基于較小的遺傳抗性克隆的擴(kuò)增的二級(jí)抗性機(jī)制，或允許轉(zhuǎn)錄適應(yīng)所需的時(shí)間。
總的來說，這些化身準(zhǔn)確建模和預(yù)測(cè)抵抗力的能力對(duì)于他們的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。
參考資料：
[1] Morrison, C. Fresh from the biotech pipeline — 2018. Nat. Biotechnol. 37, 118–123 (2019).
[2] Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E. & Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nat. Rev. Cancer 15, 747–756 (2015).
[3] Hyman, D. M., Taylor, B. S. & Baselga, J. Implementing genome-driven oncology. Cell 168, 584–599 (2017).