2022年8月17日，遼寧師范大學(xué)七鰓鰻研究中心逄越教授課題組在《Cell Communication and Signaling》（IF: 7.525）上發(fā)表了題為“Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development"的研究論文[1]。

該研究團(tuán)隊(duì)基于Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建了條件型過(guò)表達(dá)LIP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，過(guò)表達(dá)LIP蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)出現(xiàn)心包和卵黃囊水腫等表型特征，心包腔出現(xiàn)大面積的細(xì)胞死亡，并且斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著抑制。團(tuán)隊(duì)通過(guò)多個(gè)發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)的RNA-seq技術(shù)，明確LIP介導(dǎo)鐵死亡信號(hào)通路調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育。

● 綜述

2014年課題組在七鰓鰻的神經(jīng)軸體（supraneural body）組織中分離并鑒定七鰓鰻免疫蛋白LIP，其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的識(shí)別和高效率的殺傷作用[2]。2021年課題組證明miR-4561通過(guò)靶向lip調(diào)控七鰓鰻生長(zhǎng)發(fā)育[3]。然而，LIP調(diào)控七鰓鰻生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制尚不清楚。

七鰓鰻作為一種生物，其生命周期中有幾個(gè)重要發(fā)育階段，如胚胎期、仔鰻、幼鰻、亞成體及成體期，這極大地增加了七鰓鰻的人工繁殖難度。盡管團(tuán)隊(duì)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)七鰓鰻人工繁育的工作，但要將其繁育到成體期仍存在著很多的技術(shù)難題。因此，建立一個(gè)合適的七鰓鰻基因過(guò)表達(dá)或敲除模型來(lái)探究LIP的生物學(xué)功能是困難的。與七鰓鰻相比，斑馬魚(yú)遺傳背景穩(wěn)定，基因組完整，遺傳操作簡(jiǎn)單，建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型是研究七鰓鰻LIP基因功能的好選擇。

研究團(tuán)隊(duì)基于Tet-on系統(tǒng)構(gòu)建了條件型過(guò)表達(dá)LIP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，過(guò)表達(dá)LIP蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)出現(xiàn)心包和卵黃囊水腫等表型特征，心包腔出現(xiàn)大面積的細(xì)胞死亡，并且斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著抑制。團(tuán)隊(duì)通過(guò)多個(gè)發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)的RNA-seq技術(shù)，明確LIP介導(dǎo)鐵死亡信號(hào)通路調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育。

● 研究結(jié)果

研究人員探究了LIP與鐵死亡發(fā)生的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LIP過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)中的鐵死亡標(biāo)記分子在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均出現(xiàn)顯著變化，LIP過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)表現(xiàn)鐵過(guò)載、脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽耗竭等鐵死亡生理代謝特征。維sheng素E補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)可阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化造成的鐵死亡，并成功抑制LIP過(guò)表達(dá)引起的心包和卵黃囊水腫。

此外，使用檸檬酸鐵銨或去鐵胺對(duì)鐵代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)或抑制鐵死亡發(fā)生，其引發(fā)的表型特征與過(guò)表達(dá)LIP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)誘導(dǎo)的表型特征一致，這表明LIP蛋白通過(guò)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)的鐵死亡進(jìn)而調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育。為進(jìn)一步明確LIP與鐵死亡的相關(guān)性，研究人員對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)心臟進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)顯著的鐵死亡特征（線粒體變小，膜密度增高，嵴減少）和水腫現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

圖1.LIP過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)鐵死亡導(dǎo)致其水腫

A：斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育4個(gè)時(shí)期（19、36、60 和 96hpf）的鐵死亡標(biāo)記分子的Western Blot檢測(cè)；B-D：斑馬魚(yú)胚胎鐵含量(B)、MDA含量(C)、T-GSH含量和GSH/GSSG比率(D)的代謝檢測(cè)；E：斑馬魚(yú)幼魚(yú)的代表性表型分為4組，P1為無(wú)水腫，P2為輕度水腫，P3為嚴(yán)重水腫，P4為極嚴(yán)重水腫；F：維sheng素E對(duì)過(guò)表達(dá)LIP斑馬魚(yú)存活率的影響；G：維sheng素E對(duì)96hpf斑馬魚(yú)拯救后的表型分級(jí)及代表性圖片；H：檸檬酸鐵銨和去鐵胺對(duì)96hpf斑馬魚(yú)鐵死亡調(diào)控后的表型分級(jí)；I：透射電子顯微鏡對(duì)斑馬魚(yú)心臟的亞顯微結(jié)構(gòu)檢查顯示異常水腫和線粒體變化，粉色為細(xì)胞核，藍(lán)色為正常線粒體，紅色為鐵死亡后的線粒體。

在明確LIP誘導(dǎo)鐵死亡導(dǎo)致水腫并抑制機(jī)體發(fā)育后，研究人員探究了LIP誘導(dǎo)鐵死亡的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)siRNA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到的2個(gè)重要的鐵死亡標(biāo)記分子（tfr1a和acsl4a）進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)干擾acsl4a的表達(dá)降低LIP介導(dǎo)鐵死亡導(dǎo)致的水腫表型，同時(shí)干擾tfr1a和acsl4a的表達(dá)將顯著抑制LIP過(guò)表達(dá)引起斑馬魚(yú)水腫的表型，見(jiàn)圖2。此外，羅格列酮（acsl4a的小分子抑制劑）和二氫青gao素（tfr1a的小分子抑制劑）也可顯著抑制LIP引起的水腫表型。

圖2.LIP過(guò)表達(dá)通過(guò)tfr1a和acsl4a誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生

A-D：siRNA技術(shù)干擾斑馬魚(yú)tfr1a基因表達(dá)的代表性表型(A)、效率(B)、存活率(C)和表型分級(jí)(D)。E-H：siRNA技術(shù)干擾斑馬魚(yú)acsl4a基因表達(dá)的代表性表型(E)、效率(F)、存活率(G)和表型分級(jí)(H)。I-L：siRNA共沉默斑馬魚(yú)tfr1a和acsl4a基因的代表性表型（I）、效率（J）、存活率（K）和表型分級(jí)（L）。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了LIP蛋白可作為一種鐵死亡的誘導(dǎo)劑，導(dǎo)致組織水腫并抑制個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育。該研究表明LIP是調(diào)控鐵代謝和脂質(zhì)氧化的重要分子，并加深了人們對(duì)七鰓鰻的免疫分子LIP功能的認(rèn)知，見(jiàn)圖3。

圖3.LIP介導(dǎo)鐵死亡的分子機(jī)制

● 討論

在過(guò)去幾年里，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡被認(rèn)為是一種安全有效且前景廣闊的癌癥治療新策略。團(tuán)隊(duì)在之前的研究中發(fā)現(xiàn)LIP蛋白具有選擇性識(shí)別并殺死癌細(xì)胞的能力[4]，且腫瘤細(xì)胞的死亡形態(tài)與鐵死亡相似，提示LIP可能是通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)揮腫瘤殺傷活性。這項(xiàng)全新研究結(jié)果表明，七鰓鰻LIP蛋白對(duì)鐵代謝、脂代謝和生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中，絕大多數(shù)與七鰓鰻同時(shí)期的物種都已滅絕，而現(xiàn)存的七鰓鰻作為“活化石"記載著脊椎動(dòng)物起源的整個(gè)過(guò)程，從溯源研究人類和高等哺乳動(dòng)物的遺傳、進(jìn)化、發(fā)育及生理特征等方面，七鰓鰻有著不可替代的作用。七鰓鰻作為地球上古老和神秘的生物之一，值得更多的學(xué)者去探索其奧秘。同時(shí)也期待與國(guó)內(nèi)外的同行攜手深入開(kāi)展七鰓鰻的研究，更好地造福于人類的生命健康事業(yè)。

遼寧師范大學(xué)為第一作者和通訊作者單位，該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、遼寧省“興遼英才計(jì)劃"科技創(chuàng)新人才及遼寧省教育廳重點(diǎn)研究等項(xiàng)目的資助。環(huán)特生物為本項(xiàng)目研究提供了定制的斑馬魚(yú)品系。

參考文獻(xiàn)：

[1] Du Z, Zhang D, Li J, Li Q, Pang Y. Lamprey immune protein triggers the ferroptosis pathway during zebrafish embryonic development. Cell Commun Signal. 2022;20(1):124. doi: 10.1186/s12964-022-00933-0.

[2] Pang Y, Li C, Wang S, Ba W, Yu T, Pei G, Bi D, Liang H, Pan X, Zhu T, Gou M, Han Y, Li Q. A novel protein derived from lamprey supraneural body tissue with efficient cytocidal actions against tumor cells. Cell Commun Signal. 2017;15(1):42.doi: 10.1186/s12964-017-0198-6.

[3] Ma L, Gou M, Du Z, Zhu T, Li J, Li QW, Pang Y. MicroRNA expression profile in Lampetra morii upon Vibrio anguillarum infection and miR-4561 characterization targeting lip. Commun Biol. 2021;4(1):995. doi: 10.1038/s42003-021-02525-z.

[4] Pang Y, Gou M, Yang K, Lu J, Han Y, Teng H, Li C, Wang H, Liu C, Zhang K, Yang Y, Li Q. Crystal structure of a cytocidal protein from lamprey and its mechanism of action in the selective killing of cancer cells. Cell Commun Signal. 2019;17(1):54. doi: 10.1186/s12964-019-0358-y.