近期，福建省水產(chǎn)研究所陳貝博士研究團隊與廈門大學生命科學學院的研究團隊共同在《BMC complementary and alternative medicine》上發(fā)表了題為“Photoprotective effects of Sargassum thunbergii on ultraviolet B-induced mouse L929 fibroblasts and zebrafish"的研究論文。

本項目研究由環(huán)特生物提供斑馬魚實驗支持，該研究通過L929細胞與斑馬魚模型評價馬尾藻對紫外線B誘導光損傷的保護作用，旨在探討馬尾藻乙醇提取物的光保護效應。

當前，隨著人們生活水平的逐步提升,人們對延緩皮膚衰老的需求愈加強烈,保護皮膚的意識也逐漸提高。皮膚是人體與外界環(huán)境隔離的第一道屏障。持續(xù)暴露于紫外線B（UVB），可通過改變與炎癥、氧化應激和DNA損傷相關的信號通路，引發(fā)急性或慢性的皮膚失調(diào)、損傷、皮膚癌和皮膚老化等皮膚病變。如何預防皮膚暴露UV或緩解皮膚UV損傷,從而延緩皮膚光老化日益受到人們的關注。

海藻具有豐富的生物活性化合物，具有抗氧化和抗感染的特性。通過制備馬尾藻富含酚提取物（STPE），用L929成纖維細胞和斑馬魚評價其抗UVB損傷的活性。用40%乙醇和大孔樹脂XDA-7提取并純化STPE。分析活性氧（ROS）和抗氧化標志物，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。通過炎癥細胞因子基因和蛋白表達確定STPE對UVB誘導炎癥的影響；通過蛋白印跡法測定核因子-κB（NF-κB）通路中信號分子的表達；通過Hoechst 33342染色法分析并觀察DNA凝聚情況；通過斑馬魚模型尾鰭面積和 ROS測量進行體內(nèi)評價。

結(jié)果：STPE的總多酚含量為72%，STPE降低了L929細胞中的ROS含量，提高了SOD和CAT活性，顯著降低了MDA含量，從而有效緩解了UVB輻射誘導的氧化損傷。STPE抑制TNF-α、IL-6和IL-1α的mRNA和蛋白表達。與UVB對照相比，STPE在濃度為20和40μg/mL時逆轉(zhuǎn)了DNA凝聚。此外，STPE抑制UVB照射后L929細胞中的NF-κB信號通路的激活，減輕DNA凝聚。1.67μg/mL STPE顯著增加了斑馬魚尾部fn面積，0.8-1.6μg/mLSTPE顯著消除了UVB輻射后過量的ROS。

結(jié)論：STPE通過下調(diào)NF-κB信號通路，抑制UVB誘導的氧化應激、炎性細胞因子表達和DNA凝聚，表明它可以防止UVB誘導的光損傷，并具有用于皮膚病治療的臨床開發(fā)潛力。

● 綜述

在不被臭氧層吸收的紫外線 (UV) 類型中，紫外線 B (UVB)（波長 280-315 nm）是皮膚損傷發(fā)病機制的主要環(huán)境風險因素。

UVB的波長較短,比UVA (320–400 nm) 的能量強30-40倍。許多皮膚病，如癌癥、光老化、曬傷和色素沉著，都與 UVB 暴露密切相關。由于其波長較短，UVB主要被表皮吸收；然而，它也可以穿透該皮膚層到達真皮并影響成纖維細胞的生理功能。對紫外線照射皮膚或真皮成纖維細胞的研究主要集中于DNA突變、炎癥和光老化。

海洋生物可通過物理或化學的阻隔作用、抗氧化、色素的抑制作用以及核酸和蛋白的修復功能等多種生理和生化防御機制，減少UV輻射對自身造成的損害。新近，由于皮膚健康行業(yè)對抗衰老、抗過敏和美白天然產(chǎn)品的需求不斷增長，海洋生物活性物質(zhì)逐漸被應用于抗光老化化妝品的開發(fā)中,例如海洋多酚、海洋多肽、海洋多糖、海洋類胡籮ト素、海洋萜類化合物等，這些生物活性物質(zhì)通?？赏ㄟ^多種光保護機制共同作用，緩解UV輻射對皮膚的傷害。

從腔昆布(E.cava)中提取的褐藻多酚、鵝掌菜酚和二鵝掌菜酚均可降低UVB輻射后細胞內(nèi)ROS含量，孵育褐藻多酚后細胞活力呈劑量依賴性增加,DNA損傷也顯著減少；從鐵釘菜（Ishige okamurae）中提取的褐藻多酚DPHC通過降低細胞內(nèi) ROS 水平、減少受損的DNA尾部長度，引起成纖維細胞形態(tài)變化，對UVB輻射具有強大的保護特性。

在過去的幾十年中，海藻一直是天然產(chǎn)品的重要來源，可用于尋找具有藥理和營養(yǎng)特性的新化合物。黑藻是一種重要的經(jīng)濟褐藻，分布于中國和日本海域，含有許多生物活性化合物，如吲哚衍生物、吲哚酮生物堿、醌衍生物、多酚和多糖。S. thunbergii生活在潮間帶，由于潮汐變化而發(fā)生多種變化，包括高太陽輻照度、干燥、鹽度和溫度的變化。因此，我們推測，黑曲霉中的酚類化合物可能具有紫外線防護活性。然而，據(jù)我們所知，桑伯格鏈球菌的光保護活性以前從未報道過。

據(jù)報道，小鼠 L929 成纖維細胞系是一種用于藥物/化學品光毒性評估的、有效的體外篩選測試系統(tǒng)。斑馬魚（Danio rerio），被越來越多地視為評價UVB保護化合物對鰭損傷和ROS生成的一種不錯的功效評價模型。本研究中，我們建立了一個暴露于UVB 的L929細胞和斑馬魚光損傷模型，以研究S. thunbergii富含酚類提取物 (STPE) 的 UVB 光保護活性。

● 實驗部分

1.1 STPE對斑馬魚生長的影響

收集受精后 2 天 (dpf) 發(fā)育的 AB 野生型斑馬魚胚胎，每個實驗組隨機分為 30 個胚胎。胚胎用濃度為 5、10、25、100、250、500、1000 和 2000 μg/mL 的 STPE 處理 24 小時，并暴露于紫外線治療儀。UVB 暴露后，所有胚胎以 5 dpf 計數(shù)存活率。

1.2 STPE對UVB照射斑馬魚尾鰭損傷的修復作用

收集在 2 dpf 發(fā)育的胚胎，用不同濃度的 STPE（0.56、1.67 和 5 μg/mL）處理胚胎 24 小時。從每組中隨機選擇10條斑馬魚在解剖顯微鏡下觀察它們的尾鰭，分析圖像以計算其尾鰭面積。尾鰭區(qū)域用于評估 STPE 對斑馬魚紫外線照射引起的皮膚損傷修復的影響。

1.3 STPE 對 UVB 照射斑馬魚 ROS 清除的影響

收集在 2 dpf 發(fā)育的胚胎，用不同濃度的 STPE（0.8、1.2 和 1.6 μg/mL）或 EGCG（30 μg/mL）處理胚胎 24 小時。測量胚胎 (FI) 的熒光強度，STPE對斑馬魚氧自由基清除的影響計算如下：

● 實驗結(jié)果

1. STPE 逆轉(zhuǎn) UVB 誘導的細胞活力下降

用 40% 無水乙醇在 70°C 下提取S. thunbergii兩次，用大孔吸附樹脂 XDA-7 純化得到 STPE。使用比色法 Folin-Ciocalteu 方法測定 STPE 的總多酚含量為 72%。

為了確定 STPE 細胞毒性，L929 細胞用不同濃度的 STPE（0-320 μg/mL）處理 24 小時。與未處理組相比，濃度為 10-40 μg/mL 的 STPE 對細胞活力沒有影響（p  > 0.05；圖 1a），盡管在 80 μg/mL 時觀察到細胞毒性（p  < 0.05）?；诖?，10–40 μg/mL STPE 用于后續(xù)測定。

用不同劑量的 UVB (0-320 mJ/cm 2 ) 處理細胞并培養(yǎng) 24 小時以確定誘導光損傷的適當輻照劑量。UVB 以濃度依賴性方式降低細胞活力（圖1b）；20 兆焦耳/厘米2UVB 使細胞活力降低了大約 50%，并在隨后的實驗中被選為 UVB 劑量。與實驗對照相比，單獨暴露于 UVB 后，細胞活力降低至 60%（圖1c）。然而，用 STPE (10–40 μg/mL) 預處理細胞以濃度依賴性方式逆轉(zhuǎn)了這種效應，并且在 40 μg/mL 時與 UVB 模型組顯著不同。

圖1：STPE 可逆轉(zhuǎn) UVB 引起的細胞活力下降。( a ) STPE和( b ) UVB在不同濃度或劑量下對L929細胞活力的影響，以及( c ) STPE對UVB (20 mJ/cm 2 )對L929細胞損傷的保護作用。帶有“*"的均值差異顯著（p ?< 0.05）

2. STPE 抑制氧化應激和脂質(zhì)過氧化

評估由UVB誘導的STPE對細胞內(nèi)ROS的清除作用，測量STPE對UVB暴露產(chǎn)生的細胞內(nèi)ROS的清除作用（圖2a）。與對照細胞相比，暴露于UVB的細胞中的ROS 水平增加了2.35倍。然而，用濃度增加的STPE對細胞進行24小時預處理，會導致細胞內(nèi)ROS濃度依賴性降低。

圖2：STPE抑制UVB誘導的氧化應激和脂質(zhì)過氧化。STPE對L929細胞( a ) ROS和 ( b )MDA含量以及 ( c ) SOD和 ( d ) CAT活性的影響。帶有“*"的均值差異顯著（p  < 0.05）

SOD和CAT是重要的抗氧化酶，可保護組織免受氧化損傷。MDA產(chǎn)生用于評估由于氧化應激引起的細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化。通過測量SOD、CAT 和 MDA的水平來評估STPE的保護機制。與對照組相比，UVB暴露后SOD水平降低；然而，這被20和40μg/mL的STPE預處理所消除（圖2c）。在40μg/mL的STPE處理后，CAT活性升高（圖2d）。UVB ( p < 0.05 ) 誘導的MDA含量增加（圖2 b）被 40μg/mLSTPE預處理逆轉(zhuǎn)（p  < 0.05）。

3 STPE對UVB照射斑馬魚尾鰭損傷的修復作用

近年來，斑馬魚已被廣泛用作體內(nèi)氧化應激模型，來研究紫外線輻射的保護作用。實驗方案的示意圖如圖3a所示 。本研究首先探討了 STPE 對野生型 AB 株斑馬魚生長的影響，從而為后續(xù)實驗提供有關zui大安全 STPE 濃度的數(shù)據(jù)。在紫外線照射后，STPE在濃度為10μg/mL及以上時會導致高死亡率。5μg/mL STPE未觀察到明顯異常；因此，這是斑馬魚紫外線損傷模型中使用的zui大實驗濃度。

圖3：評價STPE對UVB照射斑馬魚的光保護作用。使用受精后2天 (dpf) 的斑馬魚胚胎。a為本研究中進行的實驗方案的示意圖。b、c為UVB誘導的畸形鰭表型可以通過 STPE 減弱。d為STPE 對斑馬魚UVB誘導的 ROS產(chǎn)生的抑制作用。p值小于0.05的差異被認為具有統(tǒng)計學意義并用“*"表示。

STPE修復暴露于UVB輻射的斑馬魚皮膚損傷的潛力，如圖3b和c所示，斑馬魚的尾鰭暴露于紫外線輻射后表現(xiàn)出粗糙和起皺的表型。茶多酚對斑馬魚皮膚損傷的修復效果為29%，說明陽性對照處理顯著修復了斑馬魚皮膚損傷。用0.56、1.67和5μg/mL 的STPE處理斑馬魚導致尾鰭面積，分別與對照模型相比，對皮膚損傷修復的影響分別為3%、24% 和 6%。總的來說，STPE 對斑馬魚皮膚損傷有顯著的恢復作用。

4 STPE對UVB輻射斑馬魚的ROS清除作用

STPE對斑馬魚中UVB介導的ROS誘導的影響如圖3d所示。UVB組熒光值為6271±264（p  <0.001），高于正常對照組（1169±124），表明模型建立成功。 與UVB組相比，30 μg/mL EGCG陽性對照組（1122±39）的熒光值降低了82%（p <0.001）。STPE組在0.8、1.2 和 1.6μg/mL 濃度下的熒光值分別為 1818 ± 78、1834 ± 116 和 950 ± 30，此時與UVB組相比，細胞內(nèi)ROS積累減少了 71、71 和 85%（p < 0.001)。這些發(fā)現(xiàn)表明，STPE 對斑馬魚模型中的 ROS 具有顯著的清除作用。

● 討論

本研究中，我們從S. thunbergii中分離出富含酚類的提取物，并在體外使用L929細胞、在體內(nèi)使用斑馬魚模型評估其對UVB誘導的光損傷的保護作用。實驗數(shù)據(jù)表明，對 UVB的保護作用是通過 STPE 的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力來調(diào)節(jié)NF-κB信號通路介導的（如下圖 ）。這項研究有助于對STPE皮膚保護作用的理解。我們將繼續(xù)努力獲得一種高度純化和穩(wěn)定的STPE分子，以進一步用作潛在的保護劑，以減少因UVB引起的皮膚損傷。