核心摘要

目的：探討腦脈泰膠囊治療腦梗死的可能作用機制。

方法：腦脈泰股囊用超純水溶解成50、100、 250、500、1000、1500μg/ ml6個濃度，均分別處理30尾野生型AB系斑馬魚24h后，統(tǒng)計各組斑馬魚死亡數(shù)量，繪制濃度效應(yīng)曲線，并計算非致死濃度，篩選實驗藥物濃度。取受精后1天運動神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚，分為空白對照組、模型組、陽性對照組和腦脈泰肢囊高、中、低劑量組，每組30尾。除空白對照組外，其余各組斑馬魚用1.5%乙醇誘導(dǎo)處理斑馬魚48h建立斑馬魚外周運動神經(jīng)元損傷模型。造模結(jié)束后，陽性對照組給予L-甲狀腺素鈉0.08μmol/ L, 空白對照組和模型組給予養(yǎng)魚用水，腦脈泰膠囊低、中、 高劑量組分別給予篩選濃度的腦脈泰膠囊處理24h。藥物處理結(jié)束后，利用圖像處理軟件測量外周運動神經(jīng)元的長度，計算促神經(jīng)再生率。

結(jié)果：腦脈泰膠囊濃度在50、100μg/ml時，斑馬魚無死亡；濃度為 250μg/ml時斑馬魚開始出現(xiàn)死亡，根據(jù)濃度效應(yīng)曲線得出腦脈泰肢囊非致死濃度為170μg/ml, 故本研 究選取17、57、170μg/ml為腦脈泰膠囊低、中、高劑量組干預(yù)濃度。與空白對照組比較，模型組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度顯著縮短（P<0.01);與模型組比較，陽性對照組和腦脈泰膠囊低、 中、 高劑量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度增加（P<0.01) p="">0. 05 ) , 而腦脈泰膠囊低劑量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度降低（P<0.01）。陽性對照組和腦脈泰膠囊低、中、高組促神經(jīng)再生率分別為31%、17% 、29% 、30% 。

結(jié)論：腦脈泰膠囊對外周神經(jīng)元具有促神經(jīng)再生作用，可能為其治療腦梗死作用機制之一。

● 綜述

腦梗死又稱缺血性卒中，中醫(yī)學(xué)稱之為卒中或 中風(fēng)，是指由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，出現(xiàn)腦組織缺血、缺氧，發(fā)生病變壞死 ，進而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。腦梗死恢復(fù)期是急性期到后遺癥期的過渡階段，此階段留有不同程度的神經(jīng)功能缺損，且有復(fù)發(fā)可能 ，是決定患者預(yù)后及生活能力的關(guān)鍵時期，也是臨床治療的重要時期。

腦脈泰膠囊具有益氣活血、熄風(fēng)豁痰的功效，可用于腦梗死恢復(fù)期患者。既往研究表明，腦脈泰膠囊治療缺血性腦梗死有效率可達96. 79%，可顯著改善腦梗死患者的神經(jīng)功能和日常生活能力評分。

斑馬魚是一種與人類同源性較高的脊椎動物，具有容易獲得、生長快速、給藥方便、胚胎透明等特性，在構(gòu)建中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型方面具有重要的效用，是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥物研發(fā)的重要工具。本研究通過建立斑馬魚外周運動神經(jīng)元損傷模型，觀察腦脈泰膠囊的干預(yù)作用，為進一步闡明腦脈泰膠囊改善腦梗死患者神經(jīng)功能的可能機制提供數(shù)據(jù)支持。本研究符合實驗動物倫理學(xué)相關(guān)要求。

● 實驗方法

1. 腦脈泰肢囊非致死濃度的篩選

     腦脈泰膠囊用超純水溶解，通過預(yù)實驗結(jié)果設(shè) 置 6 個 初 始 檢 測 濃度 ，分別為50、100、250、500、1000、1500μg/ml，每個濃度均處理30尾野生型AB系斑馬魚。同時設(shè)置空白對照，給予養(yǎng)魚用水。處理24h后，統(tǒng)計各組的斑馬魚死亡數(shù)量，繪制上佳的濃度效應(yīng)曲線 ，并計算非致死濃度。

2. 腦脈泰肢囊對外周神經(jīng)損傷斑馬魚模型的影響

取1dpf運動神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚，實驗分為空白對照組、模型組、陽性對照組和腦脈泰膠囊高、中、低劑量組，每組30尾。除空白對照組外，其余各組斑馬魚用1.5%乙醇誘導(dǎo)處理斑馬魚48h，建立斑馬魚外周運動神經(jīng)元損傷模型。造模結(jié)束后，陽性對照組給予超純水溶L-甲狀腺素 鈉0.08μg/ml，空白對照組和模型組給予養(yǎng)魚用水，腦脈泰膠囊各劑量組分別給予篩選濃度的腦脈泰膠囊處理24h。藥物處理結(jié)束后，按簡單隨機抽 樣法每組隨機挑選10尾斑馬魚，在熒光顯微鏡下拍照，進行圖像分析，定量外周運動神經(jīng)元的長度（L)，計算促神經(jīng)再生率。

● 實驗結(jié)果

1. 腦脈泰膠囊非致死濃度篩選結(jié)果

表1示，腦脈泰膠囊濃度在50、100μg/ml時 ，斑馬魚無死亡；濃度為 250μg/ml時，斑馬魚開始出現(xiàn)死亡，隨著濃度的增加斑馬魚死亡率逐漸升高。利用軟件模擬曲線（圖1) 求得腦脈泰膠囊非致死濃度為170μg/ml，故本研究選取17、57和170μg/ml為腦脈泰膠囊低、中、 高劑量組干預(yù)濃度。

圖 1 腦脈泰膠囊干預(yù)斑馬魚的濃度-致死曲線

2、各組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度比較

表2示 ，與空白對照組比較，其余各組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度顯著縮短（P<0.01) ; 與模型組比較，陽性對照組和腦脈泰膠囊低、中 、高劑 量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度增加（P<0.01); p="">0. 05),而腦脈泰膠囊低劑量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度縮短（P<0.01);與腦脈泰膠囊低劑量組比較，腦脈泰膠囊中、高劑量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度增加（P<0.01) p="">0. 05)。

● 討論

中醫(yī)藥治療腦梗死恢復(fù)期具有一定的優(yōu)勢，治則以補氣血、強肝腎 、活血化瘀為主。腦脈泰膠囊以紅參大補元氣，補脾益肺；三七補益氣血， 化瘀通脈；當(dāng)歸、丹參、雞血藤、紅花、銀杏葉活 血化疲；菊花、石決明 、何首烏、石菖蒲滋陰潛陽，平肝熄風(fēng)，豁痰開竅；諸藥合用可益氣活血、 化瘀通絡(luò)、清心安神。

藥效學(xué)研究表明，腦脈泰膠囊可通過提高腦組織神經(jīng)生長因子和降低膠質(zhì)纖維 酸性蛋白表達來改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能，還能增加實驗大鼠海馬局部腦血流量，抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡。目前斑馬魚模型在帕金森綜合征、抑郁癥、癲癇、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中得到了廣泛應(yīng)用，在神經(jīng)系統(tǒng)組織器官的再生學(xué)研究中已顯示出*的優(yōu)勢。西醫(yī)治療神經(jīng)損傷疾病 主要是使用營養(yǎng)神經(jīng)藥物，但其作用機制單一，療效仍不夠理想。L-甲狀腺素鈉具有促進神經(jīng)生長發(fā)育的功能，通常作為該模 型的陽性對照藥物。

本研究結(jié)果顯示，腦脈泰膠囊中、高劑量組斑馬魚外周運動神經(jīng)元長度與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但明顯高于腦脈泰膠囊低劑量組，而腦脈泰膠囊低、中、高劑量組促神經(jīng)再生率分別為17%、29%、30%, 說明腦脈泰膠囊對外周運動神經(jīng)元損傷的斑馬魚促神經(jīng)再生作用呈濃度依賴性， 且中、高劑量的腦脈泰膠囊與陽性對照藥L-甲狀腺素鈉效果相當(dāng)，具有神經(jīng)損傷的保護作用。

由于復(fù)方中成藥的成分復(fù)雜，本次實驗顯示腦脈泰膠囊對斑馬魚的非致死濃度為170μg/ml，限制了更高濃度實驗的選擇，未來將通過分離純化進一步 提高實驗的藥物濃度，明確起效的藥用部位，并選 擇更高等級的實驗動物驗證其作用，為腦脈泰膠囊改善腦梗死患者神經(jīng)功能的機理研究提供依據(jù)。

作者：鐘小清，朱曉宇，徐懿喬，何勝旭

本文發(fā)表于：《中醫(yī)雜志》2021年6月第62卷第11期