001.問：要怎么樣復(fù)蘇細(xì)胞？

答：細(xì)胞復(fù)蘇需要準(zhǔn)備一個37℃水浴鍋、手套、鑷子，以及防護眼鏡。戴上手套，用鑷子夾住液氮罐中拿出的凍存管，然后快速在37℃水浴鍋里融解細(xì)胞。防護眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿出來的管子液氮爆炸……

002.問：培養(yǎng)基不夠用，我能不能換一下細(xì)胞培養(yǎng)基??？

答：千萬別這么做，細(xì)胞都有各自適應(yīng)的培養(yǎng)基，萬一更換培養(yǎng)條件，細(xì)胞可能無法快速適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

003.問：那能不能換血清呢？

答：換的話，盡量換同一批次的血清，畢竟不同批次的血清，質(zhì)量不一樣，所以可能會有潛在的影響，特別是更換血清品牌，需要用一批細(xì)胞進行預(yù)實驗，才行。

004.問：復(fù)蘇后應(yīng)不應(yīng)該立馬去除掉DMSO？

答：有一些細(xì)胞會對DMSO敏感，一般的培養(yǎng)條件來說，復(fù)蘇后的細(xì)胞（含有DMSO）加入*培養(yǎng)基后培養(yǎng)，一天后再換液，可以避免復(fù)蘇后細(xì)胞的生長和粘附的問題。

005.問：什么時候需要換液？

答：這個要根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)來定，當(dāng)細(xì)胞代謝加快后，應(yīng)該換液。細(xì)胞密度增大后，需要考慮傳代。

006.問：培養(yǎng)基到底要不要加抗生素？

答：其實是不推薦加抗生素的，但是很多時候，都會為了保險，加上雙抗。但雙抗只能抗細(xì)菌，不能抗真菌哦！

007.問：啥時候用5%的CO2，啥時候用10%的CO2呢？有差別么？

答：當(dāng)然有差別啦，主要看的是培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基的緩沖體系基本上都是用碳酸氫鈉緩沖體系的，培養(yǎng)基里的碳酸氫鈉的濃度決定了CO2的量，當(dāng)碳酸氫鈉達(dá)到3.7g/L的時候，需要采用10%的

CO2，當(dāng)碳酸氫鈉達(dá)到1.5g/L的時候，需要用5%的CO2。如果你用的培養(yǎng)基用的是Hank's balanced salt solution (HBS，Hank緩沖液)的話，就不能用CO2培養(yǎng)箱了哦，因為這個體系里碳酸氫

鈉濃度只有0.35g/L。

008.問：培養(yǎng)基在冰箱里的時候，紫紅色的培養(yǎng)基為啥會變暗？

答：因為冰箱里沒有5%的CO2啊，培養(yǎng)基變成堿性，當(dāng)然顏色就越來越暗了……

009.問：支原體污染是否能肉眼識別？

答：能，前提是你的眼睛有2000萬像素，以及4000倍放大變焦功能。一般來說，污染了支原體的細(xì)胞，生長狀態(tài)會變差，用肉眼基本很難判別到底是支原體污染還是你自己培養(yǎng)的時候在培養(yǎng)

基里多加了一把鹽……主要還是通過PCR檢測或者是染色檢測來區(qū)分支原體污染與否的。不過一旦污染，盡量丟棄，然后查看你的血清是否安全。

010.問：細(xì)胞離心的話要怎么離心？

答：有很多地方是國產(chǎn)離心機3000rpm離心3分鐘，當(dāng)然，更推薦1000rpm離心5-10分鐘，這樣比較不容易傷害細(xì)胞。偷摸說一句，國產(chǎn)離心機的3000rpm未必能達(dá)到3000，所以問題并不大。

011.問：我細(xì)胞鋪板的時候量少點行不行？

答：可以，就是會長很慢……很慢……很慢……不知道有多慢的話，可以參考“克隆形成實驗”。細(xì)胞數(shù)量少或稀釋過多也是細(xì)胞生長的重要負(fù)面原因之一。

012.問：如何避免細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染？

答：主要還是考慮無菌環(huán)境，盡量做好操作臺的滅菌，別把培養(yǎng)基滴落在生物安全柜的入風(fēng)口，別在培養(yǎng)箱里把培養(yǎng)基打翻。這兩個地方霉菌一旦滋生，那你就只能等著用甲醛熏蒸了。紫外無法殺滅霉菌，酒精也不行，只能用火，但是一定要注意安全。復(fù)蘇的時候，水浴鍋也需要進行滅菌處理。一旦出現(xiàn)污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情況下，選擇原諒……不是……是選擇扔掉……

013.問：我復(fù)蘇后的細(xì)胞死亡率高是啥原因？

答：有這樣幾個原因哈：1）培養(yǎng)基質(zhì)量差，2）血清質(zhì)量差，3）復(fù)蘇后立馬離心，導(dǎo)致大量細(xì)胞原地爆炸，3）細(xì)胞長時間放置在-80℃，4）誤把懸浮細(xì)胞當(dāng)做是死細(xì)胞。

014.問：凍存管蓋子裂開是咋回事？

答：凍存管剛從液氮里拿出來的時候，手用力不均一很容易導(dǎo)致管子變形，導(dǎo)致管蓋受力凍裂，這個時候用鑷子夾住（有的地方推薦用止血鉗來夾）。凍存管取出后管蓋一定要擰緊，從液氮中取出后由于熱脹冷縮，管蓋很容易松動。這樣復(fù)蘇的時候，萬一有漏液，在水浴鍋里就會直接導(dǎo)致污染。

015.問：培養(yǎng)基里L(fēng)-谷氨酰胺是干嘛用的？

答：L-谷氨酰胺的主要作用是在培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在一段時間內(nèi)會在溶液中降解，但確切的降解率確實不清楚。 L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，氨對一些細(xì)胞有毒性。

016.問：培養(yǎng)基里的粉紅是干嘛用的？

答：主要為了顏色好看，引起食欲……個鬼……酚紅一般作為培養(yǎng)基中pH值的指標(biāo)：當(dāng)培養(yǎng)基呈中性時為紅色，呈酸性時為黃色，堿性時為紫色。另外，酚紅可以模擬類固醇激素（特別是雌激素）的作用。如果要避免類固醇反應(yīng)，可以在無酚紅的培養(yǎng)基里進行培養(yǎng)。

017.問：胰酶里為啥要加EDTA？

答：二價的離子會抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg這樣的二價離子。胰酶也要注意不要反復(fù)凍融哦！