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今天,我們來(lái)聊聊PCR實(shí)驗(yàn)中很關(guān)鍵的要素——耗材。作為PCR常客,了解PCR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語(yǔ)是有必要的。
市面上的PCR耗材有很多,各種品牌、規(guī)格、顏色等,讓人眼花繚亂。我們來(lái)慢慢認(rèn)識(shí)它。材質(zhì)PCR耗材的原材料通常是聚丙烯。它是一種很好的耐熱惰性物質(zhì)(使用溫度范圍為-30~140℃),能夠承受PCR反應(yīng)熱循環(huán)過(guò)程中的熱能變化,很好地封閉和保護(hù)PCR反應(yīng)體系中的物質(zhì)。
顏色常見的有白管和透明管。在傳統(tǒng)PCR實(shí)驗(yàn)中,兩者沒有區(qū)別。但是,在相同的熒光定量/qPCR實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于頂端信號(hào)讀取的qPCR儀器(在管的上方采集熒光信號(hào))來(lái)說(shuō),白管的靈敏度和一致性相對(duì)更高(下圖A和B)。這是為什么呢?
與透明管相比,A 白管得到的Ct值更低;B 白管得到的重復(fù)性更好
qPCR的核心數(shù)據(jù)是Ct值,而熒光信號(hào)是Ct值計(jì)算的數(shù)據(jù)來(lái)源,所以管內(nèi)的熒光能否完好地傳遞至檢測(cè)器是至關(guān)重要的。白色的管壁能夠阻止熒光穿過(guò)管壁和折射(下圖A),進(jìn)而防止熒光傳至加熱模塊(放管子的金屬孔壁),被模塊吸收或發(fā)生不一致反射等情況。相比于透明管,在白管的頂端能夠采集到更強(qiáng),更聚焦的熒光信號(hào)(下圖B)。
A 透明管和白管中熒光信號(hào)走向;B 分別加入等量熒光素后,熒光強(qiáng)度對(duì)比
So,假如你正在使用的是頂讀qPCR儀,那么安利一下,不妨用白管試試哦~
Tips 注意不要讓耗材長(zhǎng)期暴露在空氣中,取出耗材后,一定要快速封好包裝袋,避免用裸手接觸。有條件的話,可在超凈臺(tái)中操作。容量/尺寸/通量
容量決定了可加樣的多少(反應(yīng)體積)。加樣過(guò)多會(huì)導(dǎo)致熱傳導(dǎo)效率下降,溢出或交叉污染;而加樣不足會(huì)引起樣品蒸發(fā)損耗。qPCR儀的加熱模塊也會(huì)決定可適配的耗材和適用的反應(yīng)體系大小。通量很容易理解,就是單次實(shí)驗(yàn)?zāi)苌隙嗌賯€(gè)樣品。常見的容量和通量規(guī)格如下表所示:
單管/八聯(lián)排 | 0.2mL、0.1mL |
96孔板 | 0.2mL、0.1mL |
384孔板 | 0.02mL |
容量規(guī)格也常用標(biāo)準(zhǔn)和低容量來(lái)區(qū)分,如下圖所示。low profile(低容)耗材的高度更低,這種短小的設(shè)計(jì)減少了反應(yīng)體系上方的空間(“死體積”——無(wú)用部分),降低熱循環(huán)過(guò)程中的蒸發(fā)影響,同時(shí)能夠讓加熱模塊更大程度地將其包裹,提高熱傳導(dǎo)效率。因此,低容管也被稱為“快速”管或板。
Tips 常見的反應(yīng)體積一般為20 µL,推薦使用0.1 mL或low profile的低容反應(yīng)管。管壁厚度
PCR耗材的管壁厚度要均一,才能提供一致的熱傳導(dǎo)。超薄管壁較標(biāo)準(zhǔn)版薄50%,可進(jìn)一步減少熱屏障,帶來(lái)更快更好的反應(yīng)效果。當(dāng)然,建議選超薄的。
透明度qPCR的管蓋和封膜需要具有很高的光學(xué)透性,確保的熒光信號(hào)的穿透和傳遞,減少失真(針對(duì)頂讀qPCR儀)。管壁的透明度越高反倒會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,理由在前面解釋過(guò)。傳統(tǒng)PCR可忽略此特點(diǎn)。裙邊PCR板的裙邊指的是板的周圍延伸部分。額.......這個(gè)裙邊作用是在構(gòu)建反應(yīng)體系時(shí)為移液過(guò)程提供穩(wěn)定性支撐,以及結(jié)合自動(dòng)化工作站時(shí)提供機(jī)械強(qiáng)度和抓手。常見的有三種:無(wú)裙邊、半裙邊和全裙邊(對(duì)應(yīng)下圖A、B、C)。
Tips 簡(jiǎn)單理解就是,裙邊的意義更多在于為工業(yè)化、自動(dòng)化批量處理提供便利,與機(jī)械臂的結(jié)合。在常規(guī)科研實(shí)驗(yàn)室中可能不太需要,使用無(wú)裙邊板即可。
封板膜
PCR封板膜由透明塑料或鋁箔制成。黏性透明薄膜比較常見,適配于96或384孔板,要有足夠好的光透性。可以在封膜時(shí)用個(gè)小卡片把孔周圍的膜壓緊,避免漏氣等現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室里的貼膜boy們應(yīng)該很熟悉了吧??梢院?jiǎn)單理解為......
黏性鋁膜可能比較少見,盡管不適合qPCR,但對(duì)于光敏樣品還是合適的耗材,由于可以穿刺,便于PCR中樣品轉(zhuǎn)移。(適用于傳統(tǒng)PCR)
總結(jié)
耗材作為PCR體系的載體,對(duì)提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量是非常重要的。希望本分享能夠讓你了解PCR耗材的一些小知識(shí),為更好地選擇耗材提供幫助。ok,就到這兒了,下回見咯~
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