作者：王濤 ，戴明珠，李延川，彭逸，李春啟

作者單位：無限極（中國）有限公司；杭州環(huán)特生物科技股份有限公司

本文發(fā)表于：《中國實驗動物學(xué)報》2022年1月30日

核心摘要 ：

目的：通過體外細(xì)胞和體內(nèi)斑馬魚實驗，快速評價復(fù)方中藥提取物增強免疫力作用，并進(jìn)行初步機制研究。

方法：在體外實驗中利用 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞初步評價復(fù)方中藥提取物的生物活性；再以酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)建立斑馬魚活體免疫低下模型，分別從斑馬魚巨噬細(xì)胞生成和吞噬功能、T細(xì)胞生成及相關(guān)炎癥、免疫基因的表達(dá)等多個方面，觀察復(fù)方中藥提取物的干預(yù)作用。

結(jié)果：體外實驗中復(fù)方中藥提取物有良好的生物安全性，其在250 μg/mL 條件下可提高酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)后的RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞存活率。體內(nèi)研究表明，復(fù)方中藥提取物在 222、667、2000 μg/mL 濃度時均可明顯改善長春瑞濱誘發(fā)的斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少，同時增強巨噬細(xì)胞吞噬能力；222、667μg/mL濃度可顯著增加T細(xì)胞熒光強度；222、667、2000 μg/mL 濃度均可明顯恢復(fù)模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達(dá)量被下調(diào)的情況，并均可以顯著下調(diào)模型斑馬魚TNF-α 基因相對表達(dá)量；復(fù)方中藥提取物222μg/mL可顯著上調(diào)免疫因子 IL-12 基因表達(dá)量，在2000μg/mL 時顯著上調(diào)IFN-γ 基因表達(dá)量。

結(jié)論：體內(nèi)、外實驗表明復(fù)方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。

● 綜述

免疫力可以保護機體不受侵害，近年來，由于生態(tài)失衡所導(dǎo)致的免疫性疾病越來越多，西藥不能起到預(yù)防作用，治療效果不甚明顯且存在毒副作用。而中藥及其提取物在中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，擅治未病，講究協(xié)調(diào)和平衡，且毒副作用小，所以中藥及其提取物增強免疫力一直是新研究方向。已有實驗研究表明，靈芝多糖和生物堿均能明顯增強小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和 T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，同時可提高小鼠外周血中 IFN-γ 的表達(dá)水平。五味子多糖、白術(shù)多糖及內(nèi)酯均具有抗氧化和增強機體免疫力活性；菟絲子提取物是有效的抗菌劑，抗氧化劑和抗炎劑；黨參和茯苓在多種急性和慢性炎癥的不同實驗?zāi)Ｐ椭酗@示抗炎活性。然而大部分研究都是以傳統(tǒng)的大小鼠為動物模型進(jìn)行評價，具有造模時間長、成本高、通量小等缺點。

斑馬魚是一種國際認(rèn)可的新型模式生物，其引人注目的優(yōu)勢是胚胎發(fā)育的透明性，基于高通量的檢測體系，以及短時-高效-低費篩選。隨著“3R原則”的推行與實施，其在藥物的靶點鑒別、疾病的模型開發(fā)和毒性評價中應(yīng)用越來越廣泛。本研究采用體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)斑馬魚免疫低下模型探究復(fù)方中藥提取物對免疫力的影響，從RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞活性，斑馬魚巨噬細(xì)胞數(shù)量及其吞噬功能，T細(xì)胞數(shù)量，免疫相關(guān)基因水平多方面考察復(fù)方中藥提取物的生物安全性與增強免疫作用，對復(fù)方中藥提取物增強免疫功能進(jìn)行驗證并提供理論依據(jù)。

● 實驗方法

1. RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及復(fù)方中藥提取物處理

取生長狀態(tài)良好的RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，每孔依次加入復(fù)方中藥提取物62.5、125、250、500及1000μg/mL濃度的培養(yǎng)基，測定各孔吸光度（OD）值，確定復(fù)方中藥提取物處理濃度；

除正常對照孔及溶劑對照孔（0.1%DMSO）外，其余每孔均加入12.5μg/mL濃度的培養(yǎng)基后，再依次加入復(fù)方中藥提取物27.8、83.3、250μg/mL濃度以及陽性對照組25μg/mL濃度的培養(yǎng)基，測定各孔OD值，評價復(fù)方中藥提取物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響。

   2. 復(fù)方中藥提取物安全性考察

選取受精后2dpf的Tg（mpeg1：EGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚，設(shè)置加藥組：復(fù)方中藥提取物62.5、125、250、500、1000、2000μg/mL；同時設(shè)置正常對照組。記錄孵育至 6 dpf 時斑馬魚各臟器毒性表型與死亡情況，確定復(fù)方中藥提取物對正常斑馬魚的檢測濃度（MTC）。

3. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞生成的影響

取2dpf的Tg轉(zhuǎn)基因斑馬魚，設(shè)置加藥組：復(fù)方中藥提取物222、667、2000μg/mL；同時設(shè)置對照組，建立斑馬魚巨噬細(xì)胞減少癥模型。在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚尾部靜脈血管中巨噬細(xì)胞熒光強度（S1），并拍照。

   4. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

選取2dpfTg轉(zhuǎn)基因斑馬魚，均靜脈注射紅色熒光微球作為異物以建立斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能模型。將模型斑馬魚設(shè)置加藥組：復(fù)方中藥提取物 222、667、2000 μg/mL；同時設(shè)置對照組，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚體內(nèi)（全身）熒光微球殘留的數(shù)目（N）。

5. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚 T 細(xì)胞的影響及初步機制研究

選取2dpf Tg轉(zhuǎn)基因斑馬魚，設(shè)置加藥組：復(fù)方中藥提取物 222、667、2000 μg/mL；同時設(shè)置對照組：陽性對照百令膠囊 60.0 μg/mL，正常對照組及模型對照組，建立斑馬魚 T 細(xì)胞減少癥模型。

在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚 T 細(xì)胞熒光強度（S2），分析對 T 細(xì)胞生成的影響；收集斑馬魚樣本，提取各濃度組斑馬魚總 RNA，以 β-actin 作為基因表達(dá)的內(nèi)參，檢測目的基因腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、重組激活型基因-1（rag1）、重組激活型基因-2（rag2）、白細(xì)胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的轉(zhuǎn) 錄 水 平 ， 進(jìn) 行 復(fù) 方 中 藥 提 取 物 增 強 免 疫 力 初 步 機 制 研 究。

● 實驗結(jié)果

1. 復(fù)方中藥提取物對 RAW 264.7 細(xì)胞存活率的影響

當(dāng)復(fù)方中藥提取物濃度為62.5~250μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞存活率均>90.0%；當(dāng)復(fù)方中藥提取物濃度為500μg/mL時，RAW264.7 細(xì)胞存活率下降為 84.0%。故確定復(fù)方中藥提取物對RAW264.7細(xì)胞安全濃度為250μg/mL（見表1）。

由表2可知，酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致RAW264.7細(xì)胞存活率顯著下降；同時復(fù)方中藥提取物3倍濃度梯度干預(yù)后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性升高，復(fù)方中藥提取物250μg/mL可顯著提高RAW264.7細(xì)胞存活率（P<0.01）。

2、復(fù)方中藥提取物對斑馬魚的 MTC

在實驗終點，復(fù)方中藥提取物62.5~2000μg/mL濃度組斑馬魚均未見明顯異常，各臟器和行為狀態(tài)與正常斑馬魚相似（見圖1）。提示復(fù)方中藥提取物對正常斑馬魚的MTC為2000μg/mL。

3. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞生成的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知（表3，圖2），酒石酸長春瑞賓可導(dǎo)致斑馬魚免疫力低下，表現(xiàn)為與正常對照組比較，酒石酸長春瑞賓組斑馬魚中巨噬細(xì)胞熒光強度顯著降低；復(fù)方中藥提取物低、中、高3倍濃度梯度干預(yù)后，巨噬細(xì)胞熒光強度均顯著升高，巨噬細(xì)胞減少的改善功效分別為18%（P< 0.05）、21%（P<0.01）和22%（P<0.01）。

4、復(fù)方中藥提取物對斑馬魚巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知（表 4，圖 3），與模型對照組比較，復(fù)方中藥提取物低、中、高3個濃度組均可明顯減少斑馬魚體內(nèi)熒光微球殘留數(shù)目（P<0.05），表明復(fù)方中藥提取物具有促巨噬細(xì)胞吞噬功能作用。

5. 復(fù)方中藥提取物對斑馬魚 T 細(xì)胞生成的影響

由統(tǒng)計結(jié)果可知（表5，圖4），與正常對照組比較，模型對照組T細(xì)胞熒光強度極顯著降低，表明酒石酸長春瑞賓可誘導(dǎo)斑馬魚免疫抑制。與模型對照組比較，復(fù)方中藥提取物中濃度T細(xì)胞熒光強度顯著升高（P<0.01）；但高濃度對T細(xì)胞熒光強度無升高作用且呈現(xiàn)降低的作用趨勢。

6、復(fù)方中藥提取物對斑馬魚 T 細(xì)胞的影響及初步機制研究

6.1 RNA 濃度及純度

在實驗終點，提取斑馬魚總RNA，測定 RNA 濃度及純度，結(jié)果表明 A260/A280比值均在1.88~2.03之間，表明提取得到斑馬魚總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)q-PCR 實驗（見表6）。

6.2 對重組激活型基因rag1和rag2的影響

根據(jù)基因相對表達(dá)量公式計算，與正常對照組比較，模型對照組 rag1、rag2 基因相對表達(dá)量均顯著下調(diào)（P<0.01），復(fù)方中藥提取物干預(yù)后，低、中、高濃度組rag1、rag2基因相對表達(dá)量均顯著恢復(fù)（見表7）。

6.3 對免疫因子 IL-12 和 IFN-γ 的影響

與正常對照組比較，模型對照組 IL-12 基因相對表達(dá)量極顯著下調(diào)（P<0.001），復(fù)方中藥提取物干預(yù)后，在實驗終點，低濃度組 IL-12 基因相對表達(dá)量極顯著上升（P < 0.001），中、高濃度組出現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

與正常對照組比較，模型對照組 IFN-γ 基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.01），復(fù)方中藥提取物3倍濃度梯度干預(yù)后，IFN-γ 基因相對表達(dá)量呈劑量依賴性恢復(fù)，復(fù)方中藥提取物高濃度組 IFN-γ 基因相對表達(dá)量極顯著上升（P <0.001）（見表8）。

6.4 對致炎癥因子 TNF-α 的影響

模型對照組TNF-α基因相對表達(dá)量（1.000）與正常對照組（0.006）比較極顯著上調(diào)（P<0.001）。復(fù)方中藥提取物低、中、高濃度組 TNF-α 基因相對表達(dá)量分別為 0.023、0.002 和 0.008（P<0.001），提示復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào) TNF-α 基因相對表達(dá)量（見表 9）。

● 結(jié)論

在體外實驗中復(fù)方中藥提取物有良好的生物安全性，且可明顯提高酒石酸長春瑞濱誘導(dǎo)后小鼠單核巨噬細(xì)胞的存活率。體內(nèi)研究表明，復(fù)方中藥提取物可明顯改善長春瑞濱誘發(fā)的斑馬魚巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞數(shù)量的減少，同時增強體內(nèi)巨噬細(xì)胞的活性和吞噬能力；復(fù)方中藥提取物可明顯恢復(fù)模型對照組中rag1、rag2 基因相對表達(dá)量被下調(diào)的情況，復(fù)方中藥提取物上調(diào)免疫因子 IL-12 的表達(dá)量、IFN-γ 基因的相對表達(dá)量，復(fù)方中藥提取物可顯著下調(diào) TNF-α 基因相對表達(dá)量。體內(nèi)、外實驗表明復(fù)方中藥提取物具有明顯的增強免疫力作用。

綜上所述，復(fù)方中藥提取物具有明顯的抗炎及增強免疫力的作用。本研究可為復(fù)方中藥提取物作為新的免疫保健食品和二次開發(fā)提供指導(dǎo)性依據(jù)。