一次性系統(tǒng)是否能用于微生物培養(yǎng)？
微生物藥物蓬勃發(fā)展，諸如治療性質(zhì)粒 DNA (pDNA) 等已在下一代細(xì)胞基因療法和疫苗研發(fā)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。除此之外，抗體片段和其他通常采用微生物技術(shù)生產(chǎn)的類抗體制劑有逐漸取代傳統(tǒng)由哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物生產(chǎn)的單克隆抗體的趨勢(shì)。1人們對(duì)具有諸多優(yōu)勢(shì)的一次性系統(tǒng)是否可以用于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生了濃厚的興趣。
相比哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，微生物應(yīng)用對(duì)一次性零部件的要求更加嚴(yán)苛。原因在于微生物耗氧高、代謝產(chǎn)熱也高，需要更高的攪拌速率和通氣速率，更好的熱傳導(dǎo)性能。為確保一次性發(fā)酵罐能夠真正替代中試規(guī)模的不銹鋼生物反應(yīng)器，必須確定最關(guān)鍵的穩(wěn)健性參數(shù)和可進(jìn)行比較的性能參數(shù)。
實(shí)驗(yàn)材料
表 1：本研究中所用設(shè)備
實(shí)驗(yàn)方法
1.LB 瓊脂平板和搖瓶(預(yù)培養(yǎng) #1)
2.Biostat® RM 20 | 50 搖擺式生物反應(yīng)器(預(yù)培養(yǎng) #2)
3.Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐(流加補(bǔ)料培養(yǎng))
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
工藝工程表征
第一步，表征 Biostat STR® Microbial微生物反應(yīng)器的工藝工程參數(shù)
kLa 系數(shù)高達(dá) 680 h-1，培養(yǎng)物密度可以達(dá)到 OD600 > 300(>90 gL-1 細(xì)胞干重)，實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)(kLa可轉(zhuǎn)化為指數(shù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)工藝 (μset = 0.15 h-1) 中的氧轉(zhuǎn)移率 (OTR) 和相對(duì)應(yīng)的氧吸收率 (OUR))7，將工藝工程與生物工藝結(jié)果相匹配，確認(rèn)Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐的能力，以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。在建模工藝中，通過(guò)通氣級(jí)聯(lián)控制 DO(100% 控制輸出時(shí)最大 kLa 為 680 h-1，見(jiàn)表 2)，以此確保輸出適量氧氣保證細(xì)胞生長(zhǎng)。
表 2：在 Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐中進(jìn)行大腸桿菌流加補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)，用于控制 DO 的通氣級(jí)聯(lián)設(shè)置
Biostat® RM
生物反應(yīng)器中的微生物種子培養(yǎng)
Biostat® RM 生物反應(yīng)器可配置氧氣通氣，最高搖擺速率可達(dá) 42 rpm。與DO可能受限的搖瓶相比，它更適用于高要求的N-1代培養(yǎng)過(guò)程。
BioStat STR® Microbial
微生物反應(yīng)器中的流加補(bǔ)料培養(yǎng)
生長(zhǎng)性能
BioStat STR® Microbial 微生物反應(yīng)器的微生物培養(yǎng)性能如圖 1 所示。在最初的分批培養(yǎng)階段中，細(xì)胞生長(zhǎng)速率高，達(dá)到約 0.7 h-1(圖 1A)，整個(gè)過(guò)程持續(xù)約 5.3 小時(shí)，直到葡萄糖消耗殆盡(圖 1C)。此時(shí)，DO 曲線中出現(xiàn)特征峰(圖 2)。細(xì)胞生長(zhǎng)速率高還體現(xiàn)在生物質(zhì)的增加(圖 1B)。5.3 小時(shí)以后，以指數(shù)方式添加補(bǔ)料 1(μ = 0.15 h-1，葡萄糖在加入后立即消耗，始終保持在約 0 gL-1)，在 OD600 達(dá)到 140±10(13.2 小時(shí))時(shí)，追加補(bǔ)料2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，OD600 達(dá)到 269(圖 1A)，DCW 達(dá)到 80 gL-1 (WCW = 393 gL-1)(圖 1B)。
上述結(jié)果體現(xiàn)了發(fā)酵罐的最佳性能，實(shí)現(xiàn)了高密度培養(yǎng)。7
分批培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)，乙酸濃度達(dá)到 0.7 gL-1(圖 1C)。之后乙酸濃度持續(xù)上升，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到 5 gL-1，且過(guò)程中最后幾小時(shí)上升速度加快，但始終低于臨界生長(zhǎng)抑制濃度。8
圖 1：在 Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐中生長(zhǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物表征
注：
?以 OD600、log (OD600) 和各自對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)速率表示流加補(bǔ)料培養(yǎng)工藝中大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線圖。
? 以細(xì)胞濕重和細(xì)胞干重量 (WCW, DCW) 表示的生長(zhǎng)曲線圖。
? 葡萄糖和乙酸濃度曲線。
圖 2：指數(shù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)大腸桿菌工藝中，對(duì) DO 的控制。
工藝性能
Biostat STR® 微生物反應(yīng)器具有出色的冷卻性能，能夠支持高密度微生物培養(yǎng)工藝。
Biostat STR® Microbial微生物反應(yīng)器是否適合微生物培養(yǎng)？
速度、可靠性和產(chǎn)率是成功開(kāi)發(fā)高效生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵要素。大腸桿菌培養(yǎng)可以用來(lái)生產(chǎn)多種生物療法藥物的基礎(chǔ)原料，在高密度下生長(zhǎng)，需要大量氧氣。制藥行業(yè)迫切需要既能支持細(xì)菌培養(yǎng)物快速擴(kuò)增又能實(shí)現(xiàn)精確過(guò)程控制和高產(chǎn)量的解決方案。
全面的工藝工程表征是了解發(fā)酵罐在培養(yǎng)工藝中各項(xiàng)性能的基礎(chǔ)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐可以有效適應(yīng)高要求的微生物培養(yǎng)工藝，尤其能夠滿足此類工藝對(duì)氧傳遞和冷卻能力的要求。不僅如此，Biostat STR® Microbial發(fā)酵罐還可使用高強(qiáng)度和高靈活性的 Flexsafe® 培養(yǎng)袋，并通過(guò)生物傳感器密切監(jiān)測(cè)和控制過(guò)程，確保工藝運(yùn)行安全、穩(wěn)健。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐能夠有效的進(jìn)行高密度培養(yǎng) (OD600 > 280) 。其不僅可以精確且高效地控制 DO 和 pH，還具有良好的冷卻性能，可以滿足高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝的嚴(yán)苛要求。
總而言之，Biostat STR® Microbial 發(fā)酵罐能夠用于生產(chǎn)高活性、高密度的微生物培養(yǎng)物，即使培養(yǎng)工藝多變且嚴(yán)苛也可滿足要求。
一次性微生物反應(yīng)器Biostat STR® Microbial 性能好，適合于微生物發(fā)酵
一次性設(shè)備與不銹鋼發(fā)酵罐裝置相比，具有以下優(yōu)勢(shì)：
?易于安裝，且需要實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)車間做的準(zhǔn)備工作較少；
? 一次性設(shè)備還可節(jié)省時(shí)間和成本，并大大提高批間周轉(zhuǎn)率；
? 一次性設(shè)備還可最大限度減少污染和產(chǎn)品暴露風(fēng)險(xiǎn)，確保產(chǎn)品和操作人員安全。
除需具備上述一般性優(yōu)勢(shì)外，一次性生物發(fā)酵罐技術(shù)最終能否可行在很大程度上取決于系統(tǒng)自身的性能。Biostat STR® Microbial 微生物反應(yīng)器性能好，其 kLa 系數(shù)和傳熱能力均與成熟的不銹鋼發(fā)酵罐不相上下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物制藥企業(yè)可以在微生物工藝中利用一次性技術(shù)的諸多優(yōu)勢(shì)，縮短研發(fā)到上市階段的時(shí)間，提高商業(yè)化生產(chǎn)效率。
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