玻璃罐是實(shí)驗(yàn)室常用的懸浮培養(yǎng)設(shè)備之一，基于貼壁細(xì)胞，球狀微載體目前已成功實(shí)現(xiàn)從2D培養(yǎng)進(jìn)入3D培養(yǎng)的工藝，滿足讓細(xì)胞貼附在載體上，使載體以懸浮培養(yǎng)的形式進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。
但屏幕前的你是不是會(huì)遇到這樣的問題，用微載體在既有玻璃罐中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，出現(xiàn)了如:微載體分層，細(xì)胞貼附生長不均勻，細(xì)胞密度增殖效果差等各類問題？
如果這些問題還在困擾你，今天我們帶來的微載體X玻璃罐的培養(yǎng)細(xì)胞四大秘訣，不僅能解決你的困擾，還能幫你成為細(xì)分領(lǐng)域的細(xì)胞培養(yǎng)小能手！
下劃看重點(diǎn)↓↓↓
秘訣一：玻璃罐構(gòu)造的訣竅
傳統(tǒng)的玻璃罐主要以培養(yǎng)懸浮細(xì)胞為主，它們未必可以直接拿來使用微載體的培養(yǎng)工藝。不合適的罐體及構(gòu)造極有可能導(dǎo)致微載體在攪拌懸浮時(shí)分層。
就有可能會(huì)遭遇類似尷尬：轉(zhuǎn)速小了，微載體不能均勻的全部分散在培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速大了，細(xì)胞又不能很好的貼附和生長？
那是因?yàn)?span style="color: rgb(0, 128, 128);">罐體尺寸和槳葉大小需要匹配并滿足不同培養(yǎng)體積和載體濃度，幫助微載體能夠在合適的轉(zhuǎn)速下均勻分散，不出現(xiàn)分層的現(xiàn)象。例如罐體底部直徑偏大，攪拌漿較小，安裝位置不合適或者單槳葉的玻璃罐，都可能會(huì)有微載體分布不均勻的風(fēng)險(xiǎn)，所以選擇玻璃罐需要先嘗試滿載下高濃度載體填充的攪拌測試，并觀察微載體的分布狀態(tài)。
秘訣二：避免微載體粘壁的訣竅
當(dāng)玻璃罐出現(xiàn)微載體粘壁的情況，會(huì)導(dǎo)致微載體的損失，從而降低細(xì)胞生長面積。
可能造成如上情況的原因：
1 培養(yǎng)微載體的玻璃罐在使用前未進(jìn)行硅化，目前市面上已有無毒的硅化劑可供選擇，且已有實(shí)驗(yàn)證明其對細(xì)胞生長并無影響。
2 除了沒有硅化，通氣量的設(shè)置也會(huì)造成一定影響。過大的通氣量容易使微載體隨氣泡上浮，并且液體上表面形成大量氣泡，將微載體聚集在氣泡表面，槳葉以及罐壁上。按2L培養(yǎng)體積的玻璃罐舉例，通氣量最好在0.01~0.03lpm之間。
秘訣三：微載體進(jìn)行平衡時(shí)的訣竅
滅菌后，微載體需將上清的PBS去除，而后加入新鮮培養(yǎng)基置換過夜。再去除置換培養(yǎng)基，重新加入新的培養(yǎng)基在玻璃罐內(nèi)平衡過夜，避免稀釋培養(yǎng)基和血清濃度，導(dǎo)致貼壁效果不佳。
平衡過程中的PH需要嚴(yán)格把控在7.0~7.4，以防影響后期細(xì)胞貼附的效果。將CO2通氣設(shè)置級聯(lián)PH值，保證整個(gè)平衡過程不會(huì)出現(xiàn)PH值的大幅度變化。平衡過程中建議溫度設(shè)定比目標(biāo)值低3~4°C。
秘訣四：攪拌速率對貼壁影響的訣竅
玻璃罐里用微載體培養(yǎng)細(xì)胞，攪拌速率該如何設(shè)置才更合理？
• 速率太大，不利于細(xì)胞貼附，并且高剪切力也會(huì)使細(xì)胞受到一定損傷；
• 速率太小，部分載體容易沉降，也會(huì)導(dǎo)致貼附不均勻，甚至出現(xiàn)部分空球的問題。
細(xì)胞不同階段攪拌速率的設(shè)置是很有講究的，比如平衡階段，需要把轉(zhuǎn)速調(diào)到剛好使載體均勻分布在培養(yǎng)基中的最低轉(zhuǎn)速；而在剛完成接種細(xì)胞，可以通過間歇式攪拌，高轉(zhuǎn)速使細(xì)胞與微載體混合均勻，低轉(zhuǎn)速或者停止攪拌可以給予細(xì)胞貼附更有利的環(huán)境；或者連續(xù)式攪拌，以最低的攪拌轉(zhuǎn)速完成貼壁過程。
一般Vero細(xì)胞在接種后4小時(shí)左右即可達(dá)到95%以上的貼附率，之后可再設(shè)置恒定轉(zhuǎn)速進(jìn)行接下來的培養(yǎng)；每天要定期取樣監(jiān)測細(xì)胞密度和活率，以及在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼附及鋪展的狀態(tài)，并且觀察微載體在罐體內(nèi)是否有分層、結(jié)團(tuán)或者沉淀的現(xiàn)象來判定是否需要調(diào)整轉(zhuǎn)速。
當(dāng)然，成功的培養(yǎng)還和很多其他因素有關(guān)，如微載體的粒徑分布，也是細(xì)胞能否均勻貼壁至關(guān)重要的因素之一。
左圖：LePhinix®? EZG臺(tái)式反應(yīng)器
右圖：LeProlif®? Sphere 球狀微載體
樂純生物L(fēng)eProlif®? Sphere 球狀微載體具有優(yōu)異的抗剪切能力和出色的粒徑分布，結(jié)合樂純生物L(fēng)ePhinix®? EZG臺(tái)式反應(yīng)器，先進(jìn)智能的玻璃罐，一起助力玻璃罐里微載體培養(yǎng)細(xì)胞的工藝，更簡單，更高效！
上圖為LePhinix®? EZG 臺(tái)式反應(yīng)器中，10L培養(yǎng)體積，Vero細(xì)胞在LeProlif®? Sphere球狀微載體上的生長情況。
數(shù)據(jù)圖文顯示，利用LePhinix®? EZG的智能攪拌設(shè)置，可使Vero細(xì)胞在接種后4h就達(dá)到貼壁率95%以上；并且Vero 細(xì)胞在LeProlif®? Sphere球狀微載體上可在3~4天達(dá)到匯合階段，生長周期較短，并可長時(shí)間維持高密度及高活性，有利于接毒和細(xì)胞產(chǎn)物的收獲。
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