重組單克隆抗體是一種復(fù)雜的生物大分子，其不均一性導致抗體藥物并不是單一的物質(zhì)而是多種相關(guān)物質(zhì)的混合物。由于重組單克隆抗體在生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)冗^程中往往會發(fā)生聚集、翻譯后修飾、降解等變化，從而引起蛋白表面電荷的改變，這就是重組單克隆抗體電荷變異體形成的原因。
有研究表明，抗體電荷的變化可以改變抗體與蛋白/細胞膜的結(jié)合，從而影響抗體的組織穿透、分布和藥代動力學(PK)。電荷變異體對于蛋白質(zhì)的功能影響與其翻譯后修飾的性質(zhì)、修飾的位置和程度都有關(guān)鍵影響，充分解析其形成的分子基礎(chǔ)與影響因素有助于在抗體藥物開發(fā)中對其電荷異質(zhì)性進行控制和調(diào)整。因此，對抗體藥物相關(guān)物質(zhì)變體的分析檢測顯得尤為重要。
本文將對單克隆抗體修飾對電荷變異體的產(chǎn)生以及分析方法進行小結(jié)。
01
抗體蛋白電荷變異體形成的原因
| N末端焦谷氨酸的形成
抗體分子輕鏈和重鏈的N末端往往是谷氨酸(Glutamate，Glu)或谷氨酰胺(Glutamine，Gln)。Glu和Gln在谷氨酰胺酰環(huán)化酶(Glutaminyl cyclase)的催化作用下可發(fā)生脫水或者脫氨反應(yīng)，環(huán)化形成焦谷氨酸(pyro Glu)。
重組單克隆抗體N末端含有Gln一般會環(huán)化形成pyro Glu，而N末端含有Glu通常會以天然的形式存在。Gln在環(huán)化形成pyro Glu的過程中伴隨氨基的丟失使得所帶正電荷丟失使得抗體凈電荷減少，最終以主峰的形式被洗脫出來，而Gln未發(fā)生環(huán)化/環(huán)化不完全的抗體則會形成堿性異構(gòu)體。Glu在環(huán)化過程中脫水縮合凈電荷未發(fā)生改變。
| C末端賴氨酸切除
抗體分子重鏈C末端往往是以脯氨酸甘氨酸賴氨酸(-Pro-Gly-Lys)的氨基酸序列結(jié)尾。在細胞培養(yǎng)過程中，末端的賴氨酸(Lysine，Lys)被羧肽酶(Carboxypeptidases)切除，但是這種切除并不是完全的，Lys的不完全切除導致部分抗體蛋白出現(xiàn)Lys殘留，這部分殘留變體也被稱為賴氨酸變體。由于Lys是堿性氨基酸，含有Lys殘留的抗體以堿性變異體的形式被鑒別。
| N糖基化(唾液酸)
糖基化是蛋白或脂質(zhì)在酶的作用下被連接上糖鏈的過程，是生物體內(nèi)最重要的蛋白翻譯后修飾之一。一般重組單克隆抗體N糖基化位點發(fā)生在Fc段CH2保守序列的Asn297。該位點由2個N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和3個甘露糖(Man)組成N-糖的核心五糖結(jié)構(gòu)，在其末端增加不同的單糖(半乳糖、甘露糖、半乳糖等)使抗體呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。一般情況下，聚糖鏈呈中性，當糖鏈末端半乳糖殘基增加帶有負電荷的唾液酸后，會發(fā)生電荷的改變從而導致電荷異質(zhì)性。
在哺乳動物表達系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體中發(fā)現(xiàn)的唾液酸殘基有2種主要類型：N-乙?；?神經(jīng)氨酸(NeuAc，NANA)和N-羥乙?；?神經(jīng)氨酸(NeuGc，NGNA)。其中，NANA是人體中正常所需正常的唾液酸化作用，而NGNA不是人體合成產(chǎn)生的，若抗體藥物存在NGNA則可能具有潛在的免疫原性。由于唾液酸帶負電荷，帶唾液酸的抗體成分在陽離子交換色譜中先于主峰被洗脫出來，以酸性變異體形式被鑒別。
| 天冬酰氨的脫酰胺與天冬氨酸異構(gòu)化
天冬酰胺(Asparagine，Asn)失去氨基形成琥珀酰亞胺(Succinimide，Asu)，從而形成酸性變異體，該過程是一個不可逆的反應(yīng)。Asu不穩(wěn)定水解形成天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)或異構(gòu)的天冬氨酸(isoAsp)，該過程是可逆反應(yīng)，被v稱為Asp的異構(gòu)化。Asp的異構(gòu)化雖然不改變抗體凈電荷，但改變了電荷的分布，在陽離子交換色譜中以堿性峰的形式存在。
| 氧化
氧化甲硫氨酸(Methionine，Met)是抗體中最易被氧化的氨基酸。在較高的氧化壓力條件下，Met會被氧化生成甲硫亞砜。雖然氧化過程中不存在凈電荷的改變，但是氧化會引起抗體空間電荷分布的改變，有研究表明，Met的氧化導致堿性變異體的產(chǎn)生。此外，氧化也時常發(fā)生在甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸和色氨酸。
| 其他
研究表明，引起單克隆抗體電荷變異體的產(chǎn)生不僅有以上列舉的5種修飾形式，其中還原糖與賴氨酸殘基側(cè)鏈或者N端伯胺之間反應(yīng)形成糖化、IgG2中非典型二硫鍵的鏈接(IgG2B、IgG2A/B)、三硫鍵形成、高甘露糖、馬來酸修飾、游離巰基發(fā)生半胱氨?；鹊榷寄芤鹂贵w藥物電荷變異體的產(chǎn)生。
02
抗體蛋白電荷異質(zhì)體分析策略
蛋白質(zhì)電荷變異體分析方法主要有平板等點聚焦(Isoelectric focusing gel electrophoresis，IEF)、毛細管等電聚焦電泳(Capillary isoelectric focusing gel electrophoresis，cIEF)和離子交換色譜(Ion exchange chromatography，IEC)。
| 關(guān)于 iCIEF
IEF 和 cIEF 均屬于電泳法，它是根據(jù)被分析物的總電荷差異實現(xiàn)分離的。對于電泳法，酸性峰為低于pI值的物質(zhì)，堿性峰為高于pI值的物質(zhì)。目前IEF因為操作繁瑣、分辨率低、定量不準確而逐漸被毛細管電泳cIEF替代，而cIEF又根據(jù)成像和檢測的差異區(qū)分成傳統(tǒng)cIEF(需用壓力或改變檢測器末端電極槽儲備液的pH值的方法使溶質(zhì)通過檢測器)和全柱成像等電聚焦毛細管電泳(icIEF，采用全柱成像方式進行檢測)。
與傳統(tǒng)cIEF相比，iCIEF方法由于具備聚焦之后不需要遷移，影響因素少，通用性好等優(yōu)點，目前被認為是一種平臺化方法，在生物制藥領(lǐng)域已被廣泛用于電荷異質(zhì)性的測定，且該方法已被收錄于2020版中國藥典通則3129單抗電荷變異體測定法中，作為藥典標準方法。
| 關(guān)于 IEC
離子交換色譜 IEC 可分為陰離子交換色譜(AEX)和陽離子交換色譜(CEX)。由于大部分抗體都是弱堿性，CEX最為常用的。IEC是根據(jù)色譜峰保留時間定義酸性峰和堿性峰，當在陽離子交換色譜中，比主峰出峰早的物質(zhì)叫酸性峰，比主峰出峰晚的色譜峰叫堿性峰。
IEC 具備方法耐用、分辨率高且不需要特殊專用儀器(高效液相即可)等優(yōu)點，還可以放大用于分離制備電荷變異體做更深入的研究。但是相較于iCIEF而言，IEC法對于不同的抗體需要單獨開發(fā)新的色譜方法，且對于復(fù)雜的生物制品(如融合蛋白、雙抗、ADC等)使用IEC法的分辨率往往達不到理想的效果。
| iCIEF 和 IEC 差異
盡管毛細管電泳 iCIEF 和離子交換色譜 IEC 分析的蛋白質(zhì)酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)分布和數(shù)量基本一致，但是由于兩種分析方法原理的不同，可能會存在微小的差異。毛細管電泳iCIEF主要是基于總電荷(pI)差異進行分離，然而蛋白質(zhì)本身電荷分布的差異在離子交換色譜IEC分析中也會引起關(guān)鍵作用，因為電荷的分布可能影響抗體與色譜填料柱樹脂的相互作用。
cIEF和IEC之間的差異已在文獻中反復(fù)證明和報道，例如：用弱陽離子交換(WCX)柱分離不同保留時間的小鼠單抗組分，隨后毛細管電泳分析時顯示相同的pI。在IEF分析中，兩條重鏈上都有天冬氨酸(Asp)或一條重鏈上有一個Asp而另一條重鏈上有一個異天冬氨酸(isoAsp)的重組單抗具有相同的pI，但這些變體可以通過CEX解析。重組鼠/人嵌合抗體的Fab片段在輕鏈或重鏈上都含有焦谷氨酸(pyroGlu)，因此沒有預(yù)期的pI差異，可以通過強陽離子交換(SCX)柱進行解析。
這些例子表明，基于色譜的分離并不完全依賴于總電荷。因此，對于抗體藥物電荷變異體的研究可以結(jié)合毛細管電泳法iCIEF與離子交換色譜法IEC對蛋白進行分析，同時可結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對于異構(gòu)組分進行鑒別，是控制和穩(wěn)定重組蛋白藥物生產(chǎn)質(zhì)量的有效檢測手段。
03
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