引 言
對于嚴(yán)重疾病和現(xiàn)有療法無法治愈的病癥，細(xì)胞和基因治療是一種前景廣闊的方法。目前，已有三款Car-T產(chǎn)品在國內(nèi)上市。
盡管這些藥物取得了成功，但是由于需要大量手動和開放操作步驟、有限的標(biāo)準(zhǔn)化和自動化以及較高的工藝變異性，相關(guān)藥物生產(chǎn)仍面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
生物反應(yīng)器系統(tǒng)能夠幫助解決相關(guān)挑戰(zhàn)：其允許通過自動工藝控制、在線工藝監(jiān)測和工藝步驟(如進料或灌注)自動化減少手動操作影響和工藝變異性。搖擺式(RM)生物反應(yīng)器是CAR-T等敏感細(xì)胞培養(yǎng)的一種有效工具，并且經(jīng)常用于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)[1]。
目 的
• 搖擺式生物反應(yīng)器中T細(xì)胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)袋中細(xì)胞培養(yǎng)的比較
• 通過優(yōu)化搖擺式生物反應(yīng)器中的灌注補料方法提高培養(yǎng)生產(chǎn)率
方 法
• 細(xì)胞：從凍存PBMC(Lonza)富集的人原代T細(xì)胞，在T細(xì)胞培養(yǎng)基(添加5%人AB血清，200 U/mL IL-2)中預(yù)培養(yǎng)，使用TransAct™ (Miltenyi Biotech)活化。
• 細(xì)胞數(shù)量和活力測定：基于臺盼藍(lán)拒染法，使用CEDEX HiRes分析儀(Roche)
• 葡萄糖和乳酸測定：ABL 800 Basic(Radiometer)
• T細(xì)胞表型分析：iQue Screener Plus流式細(xì)胞分析
結(jié) 果
Biostat® RM TX生物反應(yīng)器與靜態(tài)培養(yǎng)袋的T細(xì)胞生長比較：
• 兩種培養(yǎng)方式的參數(shù)保持不變(如細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)基和補料)。
• 與靜態(tài)培養(yǎng)相比，RM TX系統(tǒng)能夠促進細(xì)胞生長(圖1)。兩種培養(yǎng)方法的細(xì)胞活力相當(dāng)。
• 使用RM TX，第7天的活細(xì)胞密度(VCD)提高3倍以上(圖1B)。
圖1：(A)細(xì)胞生長顯示為RM TX和靜態(tài)培養(yǎng)中的增殖倍數(shù)和活力。(B)第7天活細(xì)胞密度(VCD)。使用相同細(xì)胞供體的3個培養(yǎng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
• 第2天后，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，RM TX的葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)量更高(圖2)。
• 對于靜態(tài)和RM TX培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束時乳酸濃度趨于穩(wěn)定并且水平相當(dāng)。二者濃度接近但低于文獻(xiàn)[2]中的1.8 g/L抑制水平。
• 兩種培養(yǎng)技術(shù)在培養(yǎng)開始時都具有較高的葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)量(圖2)。
• 從第3天開始，葡萄糖消耗和乳酸生成減慢。這與接近培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞生長速度下降相關(guān)(圖1A)。
• 與培養(yǎng)方式無關(guān)的 CD3+ T 細(xì)胞類似百分比。
• CD4:CD8比值略有差異：RM TX培養(yǎng)后，輔助性T細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)數(shù)量較少，效應(yīng)T細(xì)胞(CD8 +細(xì)胞)數(shù)量較多。
圖2：RM TX和靜態(tài)培養(yǎng)袋的葡萄糖和乳酸測量。圖中顯示使用相同細(xì)胞供體的3個培養(yǎng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖3：培養(yǎng)第7天T細(xì)胞表型的流式細(xì)胞分析。CD4+和CD8+細(xì)胞以CD3+細(xì)胞的百分比進行計算。圖中顯示使用相同細(xì)胞供體的3個培養(yǎng)物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
通過優(yōu)化灌注策略延長培養(yǎng)時間并改善細(xì)胞生長
• 葡萄糖測定表明，低葡萄糖水平可能是細(xì)胞生長的限制因素(圖1A和圖2)。
• 當(dāng)葡萄糖濃度降至0.5 g/L以下時，灌注率加倍。
• 通過增加灌注率使葡萄糖濃度保持在0.5 g/L以上，同時導(dǎo)致乳酸濃度下降(圖4)。
• 利用優(yōu)化灌注策略，使細(xì)胞在16天延長培養(yǎng)時間內(nèi)基本呈現(xiàn)線性生長(圖5)。
圖4：RM TX培養(yǎng)物的葡萄糖和乳酸測定。直至第8天，使用方法中描述的補料策略。由于葡萄糖濃度在第8天降至0.5 g/L以下，從當(dāng)天開始將灌注率增加至600 mL/天。
圖5：采用高灌注率的RM TX培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生長和活力(黃色)。采用標(biāo)準(zhǔn)灌注的RM TX細(xì)胞生長數(shù)據(jù)(圖1)用于比較分析(灰色)。
結(jié) 論
與靜態(tài)培養(yǎng)袋相比，Biostat® RM TX系統(tǒng)在搖擺混勻的條件下能夠促進細(xì)胞生長(圖6)。
培養(yǎng)液分析可以增加對工藝的理解并用于改進生產(chǎn)。本研究表明，通過分析葡萄糖等常見的培養(yǎng)基成分，可以改進生產(chǎn)率。
未來可將培養(yǎng)液分析擴展到氨基酸、生長因子和細(xì)胞因子等培養(yǎng)基組分，用于優(yōu)化補料策略(批式補料、灌注速率等)，從而改善工藝性能并降低產(chǎn)品成本。
利用高灌注率培養(yǎng)，細(xì)胞密度接近5×107c/mL，即在Biostat® RM TX系統(tǒng)中每批次培養(yǎng)能夠產(chǎn)生5×1010個細(xì)胞。該數(shù)量足以用于相關(guān)細(xì)胞治療[3]。
圖6：Biostat® RM TX系統(tǒng)配有自動控制單元和兩個搖擺平臺。與一次性Flexsafe® RM TX培養(yǎng)袋結(jié)合使用，該系統(tǒng)能夠提供適合細(xì)胞生長的自動化、波浪混合和密閉環(huán)境。
Biostat® RM TX系統(tǒng)適用于工藝開發(fā)以及細(xì)胞增殖。該系統(tǒng)可用于分批補料、灌注工藝或不同培養(yǎng)模式的組合。
相關(guān)閱讀
[1] Vormittag, P., Gunn, R., Ghorashian, S., & Veraitch, F. S. (2018).A guide to manufacturing CAR T cell therapies.Current Opinion in Biotechnology, 53, 164–181.
[2] Fischer, K., Hoffmann, P., Voelkl, S., Meidenbauer, N., Ammer, J., Edinger, M., Gottfried, E., Schwarz, S., Rothe, G. and Hoves, S. et al.(2007) Inhibitory effect of tumor cell-derived lactic acid on human T cells.Blood 109, 3812–3819
[3] Brudno JN, Kochenderfer JN.Recent advances in CAR T-cell toxicity:Mechanisms, manifestations and management.Blood Rev. 2019;34:45-55. doi:10.1016/j.blre.2018.11.002
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