上游細(xì)胞培養(yǎng)是生物制藥生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟，對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量有著直接影響，是生產(chǎn)高質(zhì)量生物藥物的關(guān)鍵步驟之一。旨在提高生產(chǎn)效率、降低成本并確保生物藥物質(zhì)量的一致性，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和市場(chǎng)對(duì)高效、可持續(xù)生產(chǎn)的需求增加，工藝開發(fā)與優(yōu)化變得尤為重要。
細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中一項(xiàng)重要的技術(shù)，涉及細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇、細(xì)胞適應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老和細(xì)胞死亡等過程。以下是一些關(guān)于工藝開發(fā)及優(yōu)化-細(xì)胞培養(yǎng)的建議：
工藝開發(fā)的實(shí)踐
1.1 選擇合適的細(xì)胞系
細(xì)胞株的選擇是上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)的首要步驟。通過篩選和優(yōu)化細(xì)胞株，可以提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本并確保產(chǎn)品的一致性。選擇具有高表達(dá)能力和穩(wěn)定遺傳特性的細(xì)胞株是關(guān)鍵的決策。
1.2 培養(yǎng)基優(yōu)化
培養(yǎng)基的成分和配方對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)有著直接的影響。通過系統(tǒng)的培養(yǎng)基優(yōu)化，可以調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)濃度、添加生長因子和調(diào)控pH值，從而提高培養(yǎng)效率和產(chǎn)物質(zhì)量。
1.3 發(fā)酵過程優(yōu)化
發(fā)酵過程是上游細(xì)胞培養(yǎng)的核心環(huán)節(jié)，其操作條件直接關(guān)系到細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)。工藝條件包括溫度、濕度、氧氣濃度、二氧化碳濃度等。這些條件對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)有重要影響，可以通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的工藝條件，以保證細(xì)胞的正常生長和產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)關(guān)鍵參數(shù)：通過觀察細(xì)胞形態(tài)、測(cè)定細(xì)胞數(shù)量、檢測(cè)細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)等方法，監(jiān)控細(xì)胞的生長和分化情況，采取及時(shí)的反饋控制，可以保持培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性。
1.4 探索新的培養(yǎng)方法
不斷探索新的培養(yǎng)方法和技術(shù)，如微載體培養(yǎng)、三維培養(yǎng)、低溫培養(yǎng)等，以提高細(xì)胞的生長效率、分化能力和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
1.5 質(zhì)量檢測(cè)和控制
在生產(chǎn)過程中進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和控制，包括細(xì)胞狀態(tài)檢測(cè)、產(chǎn)物表達(dá)量檢測(cè)、培養(yǎng)基成分檢測(cè)等，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。
總之，上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)需要從多個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，包括細(xì)胞系選擇、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、傳代和擴(kuò)增方法、監(jiān)控方法、質(zhì)量控制體系以及新的培養(yǎng)方法和技術(shù)等。通過不斷優(yōu)化和改進(jìn)，可以提高細(xì)胞的生長效率、分化能力和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化：發(fā)酵過程的深度探討
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化對(duì)于生物制藥工業(yè)而言至關(guān)重要，而發(fā)酵過程作為上游細(xì)胞培養(yǎng)的核心，其操作條件對(duì)細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)有著直接且關(guān)鍵的影響。以下是針對(duì)發(fā)酵過程優(yōu)化的幾個(gè)關(guān)鍵方面的詳細(xì)展開：
2.1 溫度的精準(zhǔn)控制
在細(xì)胞培養(yǎng)中，溫度是細(xì)胞生長和代謝的重要因素之一。在實(shí)際應(yīng)用中，采用先進(jìn)的發(fā)酵罐控制系統(tǒng)，首先選擇高精度的溫度傳感器，再通過PID(比例-積分-微分)控制算法調(diào)整加熱和冷卻設(shè)備，以維持目標(biāo)溫度。例如，對(duì)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)，可以在不同生長階段調(diào)整最適溫度，例如在細(xì)胞擴(kuò)增階段提高至37攝氏度，而在表達(dá)階段降至33攝氏度。這樣的溫度調(diào)控能夠更好地滿足細(xì)胞在不同生長階段的需求，提高生產(chǎn)效率。
2.2 氣體流速和混合度的優(yōu)化
控制系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，建立反饋控制系統(tǒng)，使攪拌速度和氣體進(jìn)氣速率能夠根據(jù)需要進(jìn)行即時(shí)調(diào)整；以及安裝高精度的電極，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)罐內(nèi)氧氣和二氧化碳濃度，以指導(dǎo)混合度和氣液傳質(zhì)的調(diào)整。例如，增加攪拌速度可改善混合度，而調(diào)整氣體進(jìn)氣速率則影響氣液傳質(zhì)效率。在真實(shí)生產(chǎn)中，通過這樣的模擬和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，能夠更好地指導(dǎo)操作參數(shù)的選擇，以達(dá)到最佳的氣液傳質(zhì)效果。
2.3 溶氧控制與傳質(zhì)的平衡
通過在線溶氧傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧水平，并結(jié)合反饋控制系統(tǒng)調(diào)整攪拌速度和氣體流速。例如，在細(xì)胞密度較高的情況下，可以增加氣體流速，提高溶氧水平。這樣的溶氧控制不僅有助于防止細(xì)胞窒息，還能夠促進(jìn)細(xì)胞的正常代謝，提高產(chǎn)物表達(dá)。
2.4 pH值的精準(zhǔn)調(diào)控
在工藝實(shí)踐中，采用酸堿控制系統(tǒng)，結(jié)合定期自動(dòng)添加酸堿溶液的方式，以確保發(fā)酵罐內(nèi)pH值穩(wěn)定在目標(biāo)范圍。例如，CHO細(xì)胞培養(yǎng)中，通過添加緩沖溶液，可以防止pH值的劇烈波動(dòng)。通過定期的pH監(jiān)測(cè)和調(diào)整，維持發(fā)酵環(huán)境的穩(wěn)定，有助于確保細(xì)胞在適宜的酸堿條件下生長，保證產(chǎn)物的質(zhì)量。
2.5 傳感技術(shù)在優(yōu)化中的應(yīng)用
在實(shí)際生產(chǎn)中，使用高精度的在線傳感器，例如光學(xué)溶氧傳感器和pH傳感器，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)關(guān)鍵參數(shù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，以便后續(xù)分析和優(yōu)化。通過這些傳感器，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正異常情況，確保操作條件的穩(wěn)定性。例如，在一個(gè)具體的案例中，通過引入高精度的溶氧傳感器，成功減少了培養(yǎng)基中氧氣濃度的不均勻性，進(jìn)而提高了細(xì)胞的生長速率和產(chǎn)物表達(dá)水平。
2.6 智能化和數(shù)據(jù)分析的整合
建立實(shí)時(shí)和歷史數(shù)據(jù)分析，用于預(yù)測(cè)工藝中的變化趨勢(shì)，并提供實(shí)時(shí)建議或監(jiān)測(cè)任何潛在問題。結(jié)合智能模型和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析結(jié)果，持續(xù)優(yōu)化過程中的控制策略，確保高效、穩(wěn)定和一致性。
通過對(duì)這些關(guān)鍵方面的詳細(xì)展開，可以更全面地理解發(fā)酵過程的優(yōu)化策略，為實(shí)際生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)工藝提供指導(dǎo)和啟示。這種深度的探討不僅有助于解決當(dāng)前生產(chǎn)中的挑戰(zhàn)，也為未來細(xì)胞培養(yǎng)工藝的進(jìn)一步創(chuàng)新提供了方向。
如何放大以及工藝策略
工藝放大的目標(biāo)以及策略是在規(guī)模逐漸擴(kuò)大的情況下，保證細(xì)胞在穩(wěn)定的環(huán)境中生長并且進(jìn)行產(chǎn)物的表達(dá)?？剂堪?xì)胞密度、生長速率、活率、產(chǎn)物表達(dá)量和糖基化水平等等因素。在工藝的放大過程中關(guān)鍵控制參數(shù)會(huì)分為兩種類型：一種是過程參數(shù)，例如溫度、DO和pH、營養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物、滲透壓等。另一種是受體積和幾何尺寸影響，例如P/V、剪切力、KLa等。通?？剂恳韵聨c(diǎn)因素：
細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化的整體考量
一次性反應(yīng)器工藝轉(zhuǎn)移 – Agitator Speed
3.1 攪拌軸功率P計(jì)算
攪拌軸功率 P 與反應(yīng)器直徑D ，攪拌軸直徑d，液柱高度H 。攪拌槳速度n，液體粘度μ,流體密度ρ,重量加速度g以及攪拌器的形式和反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)等有關(guān)。
對(duì)于牛頓型流體，通過因次分析和實(shí)驗(yàn)研究可以得到如下關(guān)聯(lián)式：
其中Np為攪拌軸公里特征常數(shù)；
ReM 攪拌雷諾系數(shù)，F(xiàn)r為攪拌弗魯特?cái)?shù)，K和攪拌器的型式和反應(yīng)器的幾何尺寸有關(guān)的常數(shù)。
3.2 恒定功率輸出
P/V和攪拌功率(Np，Power Number)、罐體直徑、攪拌槳直徑、工作體積、液體密度等很多因素有關(guān)，一定程度上體現(xiàn)了混合程度，影響培養(yǎng)體系的混合和傳質(zhì)。因此恒定P/V被推薦為很多工藝放大的準(zhǔn)則，是當(dāng)前最常采用的放大策略。考慮到細(xì)胞剪切力的耐受性不同，常見的P/V范圍在10-40 W/m3。
3.3 攪拌恒定等體積功率放大
以單位體積培養(yǎng)液所消耗的攪拌功率相等為基準(zhǔn)進(jìn)行放大，在幾何尺寸相似的情況下：
根據(jù)小罐的參數(shù)可計(jì)算的大罐攪拌轉(zhuǎn)速，該轉(zhuǎn)速還需結(jié)合其他參數(shù)，如線速度和KLa ，以及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)綜合衡量后作出一定調(diào)整。
3.4 恒定葉端速度(Tip Speed)
培養(yǎng)工藝中，攪拌槳剪切力是需要考慮的重要因素之一。 建議哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最大耐受流體速度，在玻璃罐和不銹鋼攪拌生物反應(yīng)器中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的典型范圍為1-2m/s，通常，當(dāng)增加到更大的生物反應(yīng)器規(guī)模時(shí)，基于恒定葉端速度的放大會(huì)減少特定功率輸入。
對(duì)于攪拌槳葉端的剪切力，一般可通過Tip Speed (m/s)=π xd xn 來表示，以及積分剪切因子；
恒定混勻時(shí)間是比較簡(jiǎn)單的一個(gè)放大準(zhǔn)則，也可以作為放大的依據(jù)。但在小規(guī)模培養(yǎng)中(3L以下)體積可以很快達(dá)到混勻時(shí)間，而更大的體積則需要更高的葉端速度才能達(dá)到混勻。這就會(huì)導(dǎo)致剪切力的提高，造成細(xì)胞的損傷。
3.5 恒定KLa
KLa是氧氣從氣相進(jìn)入到液相的速率。反應(yīng)器中工藝放大的關(guān)鍵，O2作為細(xì)胞的重要營養(yǎng)物質(zhì)，影響細(xì)胞的生長及代謝。恒定的KLa放大準(zhǔn)則給細(xì)胞提供了相同的氧傳遞環(huán)境。但KLa的測(cè)定受很多因素影響。比如培養(yǎng)過程中攪拌速度、通氣量等等，在實(shí)際操作過程中，KLa隨著工作體積的增加而增加。當(dāng)達(dá)到一定體積后，KLa CO2又會(huì)和KLa相互影響，提高了KLa恒定放大難度，我們需要很多測(cè)試方法和分析來確定合適的KLa。
氧傳遞系數(shù)KLa的測(cè)定：
• 測(cè)定培養(yǎng)基：0.1% (w/w) F68 + 6 g/L NaCl in DI water at 37℃
• 過程參數(shù)：Agitator 攪拌轉(zhuǎn)速、Sparge空氣分布管孔徑、Vw裝液量、Gas Flow
• 測(cè)定過程：
1. 空氣平衡培養(yǎng)基，DO電極100%標(biāo)定；
2. 設(shè)定測(cè)定Agitation和Sparge rate；
3. 通入氮?dú)饨档虳O至小于5 %；
4. 通入空氣直至DO升高至高于95 %；
5. 重復(fù)上述步驟測(cè)定其他條件下的KLa值；
6. 計(jì)算KLa值，dDO/dt= KLa (DOt-Dot-1 )Sparge
除此以外，還有很多的因素會(huì)影響，一定的放大規(guī)模后還需要考慮pCO2對(duì)細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)的負(fù)面影響。小體積培養(yǎng)時(shí)主要是由于通入的氣體在上升過程中可以帶走大部分細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2，基本不用考慮CO2去除。反而大體積培養(yǎng)中，CO2會(huì)隨著反應(yīng)器規(guī)模的擴(kuò)大而降低去除能力。液體的氣體飽和度和氣泡量直接影響CO2去除，可以提高通氣量并減少氣泡停留時(shí)間可以加快移除。
培養(yǎng)應(yīng)用案例
本次實(shí)驗(yàn)使用CHO-K1 細(xì)胞，細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從凍存管中復(fù)蘇，然后每三到四天在搖瓶中進(jìn)行傳代擴(kuò)增。待細(xì)胞量足夠后，將細(xì)胞接入CytoLinX WB®及CytoLinX® BR-200生物反應(yīng)器繼續(xù)培養(yǎng)：
4.2細(xì)胞培養(yǎng)生長曲線和生化數(shù)據(jù)如圖：
CytoLinX® BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器在細(xì)胞培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出很好的工藝參數(shù)的控制效果：
CytoLinX®系列生物反應(yīng)器 ，在細(xì)胞培養(yǎng)方面表現(xiàn)出很好的工藝參數(shù)穩(wěn)定控制的效果 ，為重組蛋白及抗體的生產(chǎn) 、放大及提供了一個(gè)可靠的 、高效的解決方案。
CytoLinX® GB臺(tái)式玻璃反應(yīng)器
? 靈活性強(qiáng)，適配度高，更多選擇讓工藝開發(fā)和表征更加靈活；
? 關(guān)鍵工藝參數(shù)，如溫度，pH，DO 等數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)反饋以及穩(wěn)定控制；
? 大泡，微泡均可選擇，滿足多種工藝需求。
CytoLinX® BR一次性罐體式反應(yīng)器
? 智能PID參數(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)控且穩(wěn)定控制培養(yǎng)參數(shù)；
? 設(shè)備配件均采用進(jìn)口品牌，結(jié)合自動(dòng)化軟件，高精度反饋控制；
? 底通設(shè)計(jì)，能夠靈活組合微泡、中泡、大泡設(shè)計(jì)，優(yōu)化工藝、提高效率且穩(wěn)定。
掃描二維碼，
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