隨著各種病毒的流行和爆發(fā)，
人們需要更多的
人用和獸用病毒性疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)
疫苗的高產(chǎn)能需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，而大規(guī)模貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)，繁殖。
貼壁細(xì)胞對(duì)于放大是一個(gè)挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)使用的轉(zhuǎn)瓶，細(xì)胞工廠等，耗材用量高，占地面積大，培養(yǎng)成本高，而隨著新科技的發(fā)展微載體技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越成熟，現(xiàn)在微載體在一次性反應(yīng)器的應(yīng)用也比較成熟，在新建藥品生產(chǎn)產(chǎn)線中一次性反應(yīng)器的選擇越來(lái)越多。
一次性反應(yīng)器生產(chǎn)可控性更高、效率更高、靈活；可省去傳統(tǒng)不銹鋼生物反應(yīng)器所需的清潔驗(yàn)證工作，同時(shí)隨著灌流等上游技術(shù)的完善，生物制藥的生產(chǎn)逐步朝著更小的上游培養(yǎng)規(guī)模和更大的下游純化規(guī)模的方向發(fā)展，一次性在灌流相關(guān)的應(yīng)用也更加智能化。
世界范圍內(nèi)的許多國(guó)家的絕大多數(shù)減毒或滅活疫苗類型的人用和獸用疫苗都在使用微載體進(jìn)行生產(chǎn)。
基于微載體生產(chǎn)的疫苗包括：
脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、麻疹病毒(Measles virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、流感病毒(Influenza virus)、日本乙型腦炎疫苗(JEV)、埃博拉病毒(ZEBOV)和口蹄疫病毒(FMDV)等疫苗。
同時(shí)，還有利用微載體生產(chǎn)的很多在研的病毒性疫苗，如基孔肯尼亞病毒(Chikungunya virus)、登革熱病毒(Dengue fever virus)、手足口病(EV71)、漢坦病毒(Hantaan virus)、西尼羅病毒(West Nile virus)、呼吸道合胞體病毒(RSV)和黃病毒(Yellow fever virus)等病毒性疫苗。與其他細(xì)胞培養(yǎng)工藝相比，微載體培養(yǎng)工藝可以提高產(chǎn)量，降低成本，并減少污染[1]。
另外，微載體培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗研制中也有廣泛應(yīng)用：
如豬瘟(CSFV)、豬偽狂犬病(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、犬瘟熱病毒疫苗(CDV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬圓環(huán)病毒(PCV2)等病毒性疫苗。
微載體的選擇方法
球狀微載體是指直徑在60-250μm，適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微球。自Van Wezel等人在1967年用DEAE-Sephadex A-50研制出第一種微載體以來(lái)，經(jīng)過(guò)市場(chǎng)中半個(gè)多世紀(jì)的應(yīng)用和優(yōu)化，目前微載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗、單克隆抗體、重組蛋白、細(xì)胞治療、干細(xì)胞培養(yǎng)、原代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增、細(xì)胞肉、組織再生和藥物遞送等多個(gè)生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
球狀微載體關(guān)鍵參數(shù)[2]
1. 表面電荷：
通常情況下，微面帶正電荷，電荷的密度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。微載體的電荷密度控制在1-2 meq/g范圍內(nèi)，若低于1meq/g，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞吸附不充分或不吸附的情況，但電荷密度過(guò)大，則會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
2. 直徑大?。?/strong>
微載體的直徑一般不低于50-70nm，直徑太小會(huì)抑制細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。一般情況下，微載體直徑控制在100-250nm范圍內(nèi)比較適宜。同時(shí)，也要最小化微載體直徑均勻一度的差異，以保證收獲細(xì)胞的時(shí)間和密度的一致性。
3. 密度：
微載體的密度要比培養(yǎng)基密度略大一些，以便與培養(yǎng)基分離，但也不能太大，要保證在低轉(zhuǎn)速時(shí)可以懸浮起來(lái)，以免高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力損傷細(xì)胞，所以微載體的密度一般為1.03-1.05g/ml。
4. 接種密度：
細(xì)胞接種密度跟細(xì)胞類型、微載體用量和培養(yǎng)條件等有很大關(guān)系，通常情況下，微載體用量在3-20g/L范圍。根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)情況，每個(gè)小球細(xì)胞接種量在10-50個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞最終可擴(kuò)增3-10倍。
目前，微載體培養(yǎng)技術(shù)主要應(yīng)用在病毒性疫苗生產(chǎn)中，有很多種類的病毒疫苗生產(chǎn)都達(dá)到了1000-6000L的規(guī)模，且還有很多在研的新型病毒疫苗利用微載體技術(shù)進(jìn)行放大培養(yǎng)。
微載體培養(yǎng)技術(shù)在病毒性疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用得益于Vero細(xì)胞的發(fā)展和應(yīng)用。Vero 細(xì)胞系是第一個(gè)被 WHO 批準(zhǔn)用于生產(chǎn)人用病毒疫苗的連續(xù)細(xì)胞系 (CCL) ，Vero 細(xì)胞作為人類疫苗基質(zhì)已有 30 多年的經(jīng)驗(yàn)，在全球生產(chǎn)和銷售了數(shù)億劑疫苗[1]。由于Vero細(xì)胞是干擾素表達(dá)缺陷型細(xì)胞，固有免疫反應(yīng)較弱，因此它對(duì)多種病毒易感，且易產(chǎn)生高滴度的病毒。
因此，Vero細(xì)胞在病毒性疫苗行業(yè)的應(yīng)用地位如同CHO在抗體領(lǐng)域的地位一樣重要。另外，微載體還適合其他多種貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)，如MDCK、MARC-145、BHK-21和PK-15等，這些細(xì)胞在各種類型病毒性疫苗的生產(chǎn)中起著重要作用。
為了滿足市場(chǎng)對(duì)微載體的需求，
BioLink公司推出
Puredex® Cyto-1微載體。
Puredex® Cyto-1是一類基于交聯(lián)葡聚糖基架,帶有正電荷基團(tuán)的微載體，它可以為細(xì)胞提供廣闊的附著面，從而提高細(xì)胞密度，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的目的。Puredex® Cyto-1微載體不僅為貼壁細(xì)胞改變培養(yǎng)方式提供了可能，更方便優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，實(shí)現(xiàn)降本增效的目的。Puredex® Cyto-1微載體可以用于多種宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。
Puredex® Cyto-1微載體參數(shù)表
使用百林科生產(chǎn)Puredex® Cyto-1微載體在CytoLinX® BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
Vero細(xì)胞貼壁情況：
| 
| 
|
| Vero細(xì)胞貼壁2 h | Vero細(xì)胞貼壁24 h |
能實(shí)現(xiàn)Vero細(xì)胞在反應(yīng)器上的放大生產(chǎn)
CytoLinX® BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器選擇
CytoLinX® BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品包括50L，200L，500L，1000L，2000L 規(guī)模，由罐體、控制器及溫度控制單元 (TCU) 集合而成，可以應(yīng)用于工業(yè)級(jí)哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)類細(xì)胞、及其他低剪切力需求的細(xì)胞培養(yǎng)。
基于DCS構(gòu)架開(kāi)發(fā)，其底層邏輯采用西門子PCS 7構(gòu)建，從而覆蓋了研發(fā)至生產(chǎn)，單臺(tái)至上游整廠的自控需求，其自控邏輯符合 ISA 88 控制標(biāo)準(zhǔn)。
軟件設(shè)計(jì)符合GMP及 21 CFR Part 11 要求。同時(shí)，為了便捷用戶使用，CytoLinX® BR 軟件界面設(shè)計(jì)極簡(jiǎn)，所有功能一目了然，且可以極大程度的滿足客戶使用需求。
自控系統(tǒng)滿足實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集及記錄、PID自動(dòng)控制、在線監(jiān)控、多參數(shù)級(jí)聯(lián)控制等功能，且擁有穩(wěn)定的pH、DO、溫度控制表現(xiàn)。
為了更高效的混合效果，百林科推出全新的底部表盤(pán)設(shè)計(jì)，可以維持較高的線性KLa。并提供微泡，中泡，大泡及多種組合的耗材解決方案，滿足各種細(xì)胞刁鉆的培養(yǎng)需求。
參考文獻(xiàn)：
1. Kiesslich, S. and A.A. Kamen, Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances, 2020. 44.
2. Merten, O.-W., Advances in cell culture: anchorage dependence. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2015. 370(1661).
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