新開發(fā)的療法，如干細(xì)胞療法，正在將醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從治療癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)橹斡膊?。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)以其分化為不同細(xì)胞類型和組織的能力改變了再生醫(yī)學(xué)。雖然人類iPSCs已經(jīng)用于自體治療，但下一個突破將是開發(fā)經(jīng)認(rèn)證的iPSCs用于現(xiàn)成的治療。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，可以通過人類白細(xì)胞抗原(HLA)消耗來降低異種iPSCs的免疫原性，從而建立GMP級的主細(xì)胞庫，用于細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)，同時降低同種異體療法的制造成本[1]。
開發(fā)基因工程的iPSCs需要在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行幾輪克隆篩選，傳統(tǒng)的有限稀釋法分離單細(xì)胞耗時長，熒光標(biāo)記分選影響高度敏感的iPSCs的存活率，并且有污染的風(fēng)險。相比之下，CYTENA的克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)利用透明微流控芯片和實時成像技術(shù)、算法，以高活力和高效率將單細(xì)胞分選和分配到96/384孔板內(nèi)。
近年來，利用此設(shè)備分離iPSCs的方法已被報道[2-4]。在這里，展示了使用UP.SIGHT在不損失多能性的情況下，對人類iPSCs溫和分離單細(xì)胞克隆在技術(shù)上是可行的，在方法優(yōu)化后的單克隆回收率高達(dá)80%。
材料與方法
來源于人成纖維細(xì)胞的對照iPSCs在無滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中，用TeSR E8培養(yǎng)基培養(yǎng)[5]。細(xì)胞匯合度到70%的時候，按1:3 ~ 1:6比例稀釋傳代。用于單細(xì)胞分選的細(xì)胞也在60- 70%的匯合度下進(jìn)行收獲，確保細(xì)胞看起來健康且未分化的狀態(tài),并以0.5-0.8x10 6個細(xì)胞/ mL的濃度在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸為單細(xì)胞懸液。將80 uL的單細(xì)胞懸液裝入芯片(EASY.ON cartridge)并安裝在UP.SIGHT上進(jìn)行單細(xì)胞分選。單細(xì)胞重懸液和孔板中的克隆培養(yǎng)基中都含有ROCK抑制劑，單細(xì)胞分選于裝有克隆培養(yǎng)基的96孔板上，分選完的板子盡快轉(zhuǎn)回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在前7天用UP.SIGHT監(jiān)測iPSCs的單克隆生長。
結(jié)果與討論
對照組采用手動有限制稀釋法，濃度為0.5個細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板 [6-7]，10天后達(dá)到了預(yù)期的10-20%的克隆率(數(shù)據(jù)未顯示)。使用UP.SIGHT進(jìn)行的第一次分選實驗在相同的條件下獲得了6%的克隆率(圖1 A)。以這些實驗設(shè)計為基準(zhǔn)，通過系統(tǒng)的逐步優(yōu)化條件來逐漸提高回收率。
首先，我們優(yōu)化了裝載在UP.SIGHT墨盒上的細(xì)胞重懸液。確定與使用原始基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，使用鹽水緩沖液后近乎使克隆恢復(fù)提高一倍(圖1 B)。其次，由于iPSCs通常需要定期更換培養(yǎng)基，這種在早期更換培養(yǎng)基的操作對脆弱敏感的iPSCs的生長是有不利的，我們測試了在分選后的前7天中通過添加補(bǔ)充制劑到培養(yǎng)基中來避免更換培養(yǎng)基組份的效果。用補(bǔ)充制劑A(圖1 C)和不同濃度的補(bǔ)充制劑B(圖1 D和E)添加到克隆培養(yǎng)基，均可以獲得更高的單克隆率，其中補(bǔ)充制劑B可提高到50%。
圖1：優(yōu)化分選提高克隆回收率
A:初始重懸細(xì)胞液條件，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件最相似。B:鹽溶液作為重懸液。C:添加了補(bǔ)充制劑A的克隆培養(yǎng)基. D-E:添了不同濃度補(bǔ)充制劑B的克隆培養(yǎng)基. F:克隆培養(yǎng)基改為添加了補(bǔ)充制劑B的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基。克隆恢復(fù)值以第7-10天克隆生長孔的百分比表示。
添加劑能夠保持分選后的培養(yǎng)板細(xì)胞在前7天不受干擾，顯著提高了克隆率。在7天后，我們獲得了更大尺寸和良好形態(tài)的克隆團(tuán)(圖2)。最后，我們替換了克隆板中的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，并使用優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行iPSCs的單細(xì)胞接種，優(yōu)化條件包括鹽溶液重懸樣品，加上適合目的的克隆培養(yǎng)基，并以優(yōu)化濃度的培養(yǎng)基補(bǔ)充物等，從而獲得高達(dá)80%的單克隆率(圖1 F)和長勢良好的克隆團(tuán)(圖2)。
(值得一提的是：此次實驗還測試了其他沒有顯著影響克隆恢復(fù)的參數(shù)。如，不同的ROCK抑制劑配方、板涂層和板類型。但不能認(rèn)為這些變量在其他實驗條件下使用時不會對克隆恢復(fù)產(chǎn)生影響。)
圖2：克隆生長與形態(tài)
使用UP.SIGHT分選單細(xì)胞到96孔板中，并在第7天進(jìn)行板底成像。
本實驗中對UP.SIGHT板成像能力也進(jìn)行了測試。從圖中能夠確認(rèn)圖像質(zhì)量足夠好，可以評估克隆的形態(tài)，以確定細(xì)胞在單細(xì)胞分選后是否保持其典型的iPSCs形態(tài)(圖2)。
圖3：用UP.SIGHT進(jìn)行克隆生長監(jiān)測
此外，UP.SIGHT上的成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)顯微鏡相比具有更快的優(yōu)勢:整個孔板(96/384孔板)的圖像采集不到6分鐘，大大減少了孔板在培養(yǎng)箱外的停留時間，尤其是384孔板。當(dāng)在全孔板上進(jìn)行初始篩選時，這一點(diǎn)特別重要，可以在多個時間點(diǎn)快速進(jìn)行成像(圖3)。
結(jié)論
本研究表明，使用UP.SIGHT分選iPSCs可獲得良好形態(tài)的克隆團(tuán)，具有較高的克隆恢復(fù)率。為了更大化克隆恢復(fù)，可通過優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞在分選前收獲時的活率和生長狀態(tài)、細(xì)胞懸液、克隆培養(yǎng)基及補(bǔ)充物，以確保細(xì)胞在分選后的第一天盡可能不受干擾；UP.SIGHT的快速平板成像功能可實現(xiàn)生長克隆的形態(tài)監(jiān)控和快速篩選。
總之，UP.SIGHT是一種多用途儀器，可實現(xiàn)高效、高質(zhì)量和節(jié)省時間的iPSCs分選和早期監(jiān)測，以選擇正確優(yōu)質(zhì)的單克隆。
參考文獻(xiàn)
[1] Jarrige, M., Frank, E., Herardot, E., et al. (2021). The future of regenerative medicine: Cell therapy using pluripotent stem cells and acellular therapies based on extracellular vesicles. Cells 10, 1–29. 10.3390/cells10020240.
[2] Chen, Y., Tristan, C.A., Chen, L., et al. (2021). A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods 18, 528–541.
[3] Vallone, V.F., Telugu, N.S., Fischer, I., et al. (2020). Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub- Cloning of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol 55.
[4] Krol, R.P., Yamashita, M., Tsukahara, M., et al. (2021). Single-cell cloning of human induced pluripotent stem cells automation and protocol optimization. In International Society for Stem Cell Research.
[5] Craig-Mueller, N., Hammad, R., Elling, R., et al. (2020). Modeling MyD88 Deficiency In Vitro Provides New Insights in Its Function. Front Immunol 11, 3327.
[6] Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., et al. (2014). Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521–based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols 2014 9:10 9, 2354– 2368.
[7] Kuo, H.H., Gao, X., DeKeyser, J.M., et al. (2020). Negligible- Cost and Weekend-Free Chemically Defined Human iPSC Culture. Stem Cell Reports 14, 256–270.
手機(jī)版
制藥網(wǎng)手機(jī)版
制藥網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：zyzhan
直播中 
預(yù)告 
預(yù)告 
