吸附色素對填料的影響：
色素沉積在層析柱中，
不僅對其分辨率，收率有影響，
更嚴重影響其使用壽命。
色素污染層析填料的具體表現(xiàn)
色素污染層析填料的具體表現(xiàn)是含有色素的中間體在層析系統(tǒng)上樣過程中，色素會首先與層析柱上層填料結(jié)合，導致層析填料由乳白色變成色素相應(yīng)的顏色，隨著上樣量和填料循環(huán)數(shù)的增加，色素會逐步擴散到中下層填料，嚴重時色素等雜質(zhì)帶來的污染能讓層析柱內(nèi)的填料塌陷。
過度積累的色素將導致填料的使用壽命降低，具體表現(xiàn)是填料載量明顯下降，填料外觀顏色變深。通常情況下，這些填料吸附的色素會被后續(xù)再生工序中的再生液去除，從而恢復(fù)填料性能，也避免吸附在填料上的雜質(zhì)污染下一個工藝循環(huán)，將蛋白質(zhì)原液的雜質(zhì)殘留降至最低，從而減淡蛋白質(zhì)中間體的顏色，實現(xiàn)更好的原液質(zhì)量。
填料吸附色素的來源
填料吸附的色素主要來源于蛋白，而影響蛋白溶液外觀、且難以去除的色素主要是由培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)和收獲過程中與蛋白分子相互作用形成的。
據(jù)文獻報道，色素廣泛存在于蛋白質(zhì)中間體和最終原液中，具體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)中間體和原液呈現(xiàn)不同的顏色，尤其在高濃度蛋白質(zhì)溶液中尤為顯著，比如哺乳動物細胞培養(yǎng)基中的維生素B12轉(zhuǎn)化為羥氧-B12之后與抗體分子結(jié)合導致粉色，鐵離子等的高氧化性使其在氧化應(yīng)激下產(chǎn)生高活性氧 (ROS) ，使抗體分子表面色氨酸殘基氧化導致黃色或黃褐色；畢赤酵母誘導中后期，AOX1醇氧化酶釋放進入發(fā)酵液，結(jié)合黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔因子形成八聚物導致綠色。另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能會引入顏色。
填料色素的去除方法
色素是一類物質(zhì)，不同來源的色素的清洗過程差異較大，可根據(jù)介質(zhì)的性質(zhì)及色素的性質(zhì)進行清洗，堿洗，酸洗，有機溶劑，變性劑都可以嘗試。根據(jù)色素的不同性質(zhì)，也可以嘗試不同的去污劑，注意避免操作中產(chǎn)生氣泡。 如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除，或驗證是否對于樣品純化造成影響。
色素的去除方法：
• 鐵離子殘留帶來的黃褐色去除：
0.1M HCl+2M NaCl；0.5M磷酸。
• 維生素B12引起的粉色去除：
1M醋酸+4%半胱氨酸；0.3M組氨酸+0.5M NaCl。
• 疏水作用力結(jié)合的色素去除：
0.5-1M NaOH。
• 脂類色素：
0.5M 非離子去污劑；70%乙醇；30%異丙醇。
• 沉積的頑固色素：
1M醋酸；1M NaOH+2M NaCl；6M鹽酸胍；8M尿素。
色素清洗過程注意事項：
• 清洗過程要綜合考慮污染物的類型及介質(zhì)的種類，清洗的同時要減少對介質(zhì)的損傷。
• 清洗使用氫氧化鈉或者其它極端條件對填料的壽命性能都有很大影響，清洗時極端條件接觸時間控制在30分鐘以內(nèi)，CIP時控制在3CV以內(nèi)。
• 清洗時除了單一的清洗方式，也可以考慮使用混合試劑進行處理，清洗過程并非是固定不變的。
• 清洗試劑應(yīng)選擇純度高的試劑，避免二次污染。
• 清洗之后要立即放到中性保存。
• 清洗狀態(tài)的確定及方法的確定要結(jié)合整個工藝過程。
• 清洗之后要對清洗過程進行驗證，保證清洗目的實現(xiàn)，可通過測定載量，流速等介質(zhì)的性能指標驗證。
填料色素去除案例展示
使用1M醋酸+4%半胱氨酸對CIP清潔后呈現(xiàn)粉色色素殘留的MaXtar ARPA填料進行再生清洗，清潔后外觀顯示可徹底清楚色素殘留。
對清潔后層析柱再生溶液進行了收集并送檢VB12含量測定，檢測報告同樣顯示無VB12。再生清洗前后對比
左：清洗前；右：清洗后
百林科VB12含量檢測報告：
參考文獻：
[1]翁志兵,王鵬紅,趙力,等.層析填料中頑固色素去除的新方法研究[J].食品與生物技術(shù)學報, 2022(002):041.
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