針對難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因遞送,新加坡國立大學(xué)學(xué)者利用微細(xì)胞囊泡技術(shù)(mCVT)制造出了一種嵌合基因遞送系統(tǒng),該研究利用了美國Genizer公司的脂質(zhì)體擠出儀,并將成果見刊于Nanoscale雜志上。原文全名為:Micro cell vesicle technology (mCVT): a novel hybrid system of gene delivery for hard-to-transfect (HTT) cells. DOI
新加坡國立大學(xué)研究團隊在本研究中,介紹了一種新型的基于微細(xì)胞囊泡技術(shù) ( micro Cell Vesicle Technology mCVT)的嵌合型基因遞送平臺系統(tǒng)。這種基因遞送平臺系統(tǒng)由細(xì)胞膜和陽離子脂質(zhì)融合而成,被用于提高難轉(zhuǎn)染(hard-to-transfect HTT)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。微細(xì)胞囊泡的細(xì)胞膜成分賦予整個復(fù)合體胞吞特異性,減少了轉(zhuǎn)染過程中的復(fù)合體細(xì)胞毒性,而陽離子脂質(zhì)負(fù)責(zé)與遺傳物質(zhì)相結(jié)合,同時為mCVTs提供了結(jié)構(gòu)完整性。
基因遞送是將外來DNA引入真核細(xì)胞的過程。如在基礎(chǔ)研究(如藥物發(fā)現(xiàn)和功能蛋白的機理研究)和臨床應(yīng)用(如基因治療)中傳遞治療性或功能性基因以改變細(xì)胞過程。有效的基因轉(zhuǎn)染不僅需要成功地將外來核酸引入細(xì)胞,而且還需要它們隨后在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運和表達(dá)。這是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù),因為DNA分子本身是帶負(fù)電荷,因此在其常規(guī)形式下很難被細(xì)胞內(nèi)化。因此,人們對開發(fā)有效的基因傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生了極大的興趣。在過去的幾十年里,人們探索了大量的載體系統(tǒng),從基于病毒的遞送系統(tǒng)到非病毒載體。盡管非病毒基因遞送載體的轉(zhuǎn)染效率相對較低,但在安全性和臨床接受度方面有望成為,其中陽離子脂質(zhì)系統(tǒng)和基于聚合物的平臺是主要的例子。表1總結(jié)了目前常用的轉(zhuǎn)染試劑或方法的主要優(yōu)缺點。
理想的非病毒基因遞送系統(tǒng)應(yīng)能有效地將所需的DNA分子遞送到特定的細(xì)胞類型中,且細(xì)胞毒性最小,以確保目標(biāo)基因的最大表達(dá)。然而,據(jù)我們所知,目前市售的轉(zhuǎn)染試劑明顯達(dá)不到這些標(biāo)準(zhǔn),特別是當(dāng)它們被用于轉(zhuǎn)染難轉(zhuǎn)染(HTT)細(xì)胞時。
HTT細(xì)胞通常包括原代細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和一些永生化細(xì)胞系,如3T3-L1(小鼠前脂肪細(xì)胞)、U937(人單核細(xì)胞)、Jurkat(人T淋巴細(xì)胞)、HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)等。據(jù)統(tǒng)計使用市售試劑對HTT細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率經(jīng)常不超過25%。HTT細(xì)胞對外來物質(zhì)和質(zhì)粒的吸收率低的原因之一是其代謝活性低。此外,這些細(xì)胞通常對所使用的轉(zhuǎn)染試劑引起的細(xì)胞擾動非常敏感,有可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
最近,鑒于細(xì)胞來源的遞送系統(tǒng)有可能在一定程度上特異性地將活性貨物分子遞送到目標(biāo)部位,因此獲得了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。事實上,許多研究已經(jīng)探索了使用單核細(xì)胞衍生的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)來定向遞送化療藥物和質(zhì)粒DNA(pDNA)到腫瘤,或者使用紅細(xì)胞衍生的DDS來延長血液循環(huán)和定向遞送pDNA到血細(xì)胞中。據(jù)推測,保留母體細(xì)胞的細(xì)胞膜成分將賦予這些基于細(xì)胞的藥物遞送系統(tǒng)識別特定目標(biāo)細(xì)胞的能力,可能通過逃避身體免疫系統(tǒng)的識別能力來促進(jìn)。
盡管有重大的治療意義,但迄今為止,基于細(xì)胞的DDS在基因傳遞方面的全部潛力在很大程度上仍未得到開發(fā)。需要解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)包括細(xì)胞來源的DDS(如外泌體形式)的繁瑣和低通量分離/生產(chǎn)過程以及次優(yōu)的基因裝載/復(fù)合技術(shù)。因此,雖然這些系統(tǒng)在內(nèi)在的靶向性方面似乎很有優(yōu)勢,但它們在產(chǎn)量和pDNA裝載效率方面有很大的局限。因此,為了克服這些限制,我們在此提出開發(fā)一種新型的嵌合基因遞送系統(tǒng),該系統(tǒng)由細(xì)胞膜成分和陽離子脂質(zhì)成分組成,前者用于增強靶細(xì)胞的內(nèi)化,后者用于增強pDNA的裝載。
在這項研究中,我們描述了微細(xì)胞囊泡技術(shù)(mCVTs)的發(fā)展,這是一種通過陽離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜融合而獲得的新型混合遞送平臺。為了生產(chǎn)mCVTs,首先用低滲水溶液處理細(xì)胞來獲得鬼影細(xì)胞(CG無細(xì)胞質(zhì)于細(xì)胞器細(xì)胞),如Goh等人所描述的。低滲溶液在質(zhì)膜上形成短暫的開口,允許清除細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)容物,同時保持質(zhì)膜的完整性。來自不同細(xì)胞懸浮在水介質(zhì)中的CG被用來水化干燥的DOTAP脂質(zhì)薄膜,隨后通過脂質(zhì)體擠出儀擠出,提供與擠出的DOTAP脂質(zhì)體相似的平均流體力學(xué)尺寸和Zeta電位的mCVTs。在這項研究中,我們證明了mCVTs能夠與質(zhì)粒復(fù)合并被目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)化,而且細(xì)胞毒性最小。有趣的是,當(dāng)從不同細(xì)胞類型產(chǎn)生的mCVTs在體外進(jìn)行比較時,對于mCVTs所來源的細(xì)胞類型,它們顯示出明顯更高的轉(zhuǎn)染效率。
制備鬼影細(xì)胞(CG無細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器細(xì)胞膜)以確保mCVTs的可重復(fù)性和安全狀況。
方法與結(jié)果 略
mCVTs的生產(chǎn)和特征分析。
與脂質(zhì)體生產(chǎn)類似,脂質(zhì)薄膜法被用來生產(chǎn)mCVTs。DOTAP薄膜與CG水合,形成包裹CG的大型多分子脂質(zhì)體。這種懸浮液被擠出,來自CG的漿膜含有DOTAP脂質(zhì)(如圖3A所示)。按照我們小組以前建立的方法,證明在擠壓后,這樣產(chǎn)生的mCVTs由脂質(zhì)和CG膜的融合組成。一般來說,mCVT的大小分布與脂質(zhì)體相似。為了證明這種方法在各種細(xì)胞系中的穩(wěn)健性和通用性,使用來自不同細(xì)胞系的CG制作了mCVTs,如一些HTT細(xì)胞(即3T3-L1)和非癌細(xì)胞(即HEK293和RAW264.7)。如圖3B所示,各種mCVTs的流體力學(xué)尺寸和PDI通常在400納米的范圍內(nèi)(PDI~0.4),與使用相同擠壓方法生產(chǎn)的DOTAP脂質(zhì)體(PDI~0.2)類似。在圖3C中,不同的配方觀察到類似的zeta電位值(約+30 mV至+40 mV),表明這種方法普遍適用于從不同細(xì)胞系產(chǎn)生的CG。有趣的是,當(dāng)mCVT3T3-L1與pDNA復(fù)配時,其大小分布與未復(fù)配的mCVTs相似,而整體zeta電位變?yōu)樨?fù)值,這可能表明復(fù)配成功(因為帶負(fù)電的pDNA使帶正電的mCVTs中和)。
A. mCVTs的示意圖,涉及細(xì)胞鬼魂和水合薄膜制成的脂質(zhì)體的融合。
B. 不同的mCVTs和帶有質(zhì)粒的mCVT3T3-L1的水動力尺寸與DOTAP脂質(zhì)體相比。所有mCVTs的尺寸都小于500納米。
C. 與DOTAP脂質(zhì)體相比,不同的mCVTs和帶質(zhì)粒的mCVT3T3-L1的Zeta電位。所有mCVTs的Zeta電位都在+30 mV以上,除了帶有質(zhì)粒DNA(5 µg)的mCVT3T3-L1,由于與質(zhì)粒DNA的相互作用而顯示出負(fù)的Zeta電位。數(shù)據(jù)代表平均值 ± SD(n = 3)。
免責(zé)聲明