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在ELISA的研發(fā)制備中尤為重要的就是它的指控流程,包括抗原設(shè)計(jì)及制備篩選,抗體制備,標(biāo)準(zhǔn)品的定量,檢測液的優(yōu)化,試劑盒的組裝,以及各種性能的驗(yàn)證。對于科研工作者來說,要制備一個(gè)好的ELISA kit,需要具備敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好,并且其試劑穩(wěn)定、易保存,操作簡便等。下面來看一下ELISA的質(zhì)控控制。
1. 抗原抗體選擇
ELISA檢測原理基于抗原抗體反應(yīng),其質(zhì)量影響了試劑盒的性能。對于大分子蛋白抗原,多采用雙抗體夾心法,使用優(yōu)的抗體對,且至少有一種為單抗,配對篩選最佳信噪比的包被和檢測抗體。對于抗原為多肽和小分子(或者偶聯(lián)物),多采用競爭抑制法,抗體的是經(jīng)過驗(yàn)證的單克隆抗體或者多克隆抗體。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品
對于標(biāo)準(zhǔn)品定量的準(zhǔn)確性,每個(gè)公司對于定量標(biāo)準(zhǔn)和方法可能會有不同,這是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。試劑盒使用的標(biāo)準(zhǔn)品多為重組蛋白或者單價(jià)的小分子, 定量可參考國際標(biāo)準(zhǔn)品,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息網(wǎng)或者一些大公司,如R&D, Abcam等。標(biāo)準(zhǔn)品的定量直接會決定試劑盒最后樣本的檢測結(jié)果。
3. 天然樣本驗(yàn)證分析
我們在選擇樣本時(shí),避免使用有外源性污染的樣本,避免血樣本出現(xiàn)溶血、細(xì)菌污染,最好使用較新鮮樣本,避免反復(fù)凍融。
血清是最為常見的檢測樣本,但是大約40%的血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測結(jié)果;常見的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子RF、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和異嗜性抗體等其他物質(zhì)等。避免其發(fā)生的方法有:
①標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。
②用2-C2H6OS加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。
③56℃ 30 min加熱血清使補(bǔ)體滅活。
在樣本檢測中,稀釋對于實(shí)驗(yàn)的成功也至關(guān)重要,稀釋過度以及稀釋不足均有可能導(dǎo)致樣本的測值低。Elisa 實(shí)驗(yàn)較為常見的一個(gè)現(xiàn)象就是鉤狀效應(yīng),即抗原與抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象,抗原過量稱為后帶效應(yīng)。當(dāng)樣本中目標(biāo)物含量很高,而沒有進(jìn)行正確的稀釋,就有可能會導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。
4. 陽性及陰性對照
用于評判試劑盒以及當(dāng)次檢測結(jié)果的客觀性和可信性。陰性對照一般選擇blank或者一定不含有受檢物質(zhì)的樣本;而陽性對照是經(jīng)檢驗(yàn)呈現(xiàn)陽性結(jié)果的樣本,其含量可用于評判當(dāng)次ELISA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性。
5. 特異性
包括交叉反應(yīng)和干擾效應(yīng),在研發(fā)過程中需消除樣本非特異性引起的假陰性和假陽性。在ELISA試劑盒中最為關(guān)鍵抗體一定是經(jīng)過反復(fù)檢測的,保證不與相關(guān)的類似物反應(yīng)。
6. 靈敏度
此標(biāo)準(zhǔn)可評估試劑盒質(zhì)量優(yōu)良的一個(gè)關(guān)鍵因素,這是由使用的抗體效價(jià)等決定的,在研發(fā)過程中,一般會優(yōu)化保證高靈敏度、低背景的檢測結(jié)果從而大大提供試劑盒的靈敏度。
7. 精密度
即為同一樣本重復(fù)測定的符合程度,可分為批內(nèi)精密度和批間精密度。一般是選取同一批次或者不同批次的試劑盒對不同濃度的樣本進(jìn)行定量檢測,需要盡量降低批次差異帶來的系統(tǒng)誤差,保證相同樣本結(jié)果的重復(fù)性。一般在研發(fā)過程中使用多個(gè)樣本檢測不同批次進(jìn)行對比,保證試劑盒通過穩(wěn)定性和重復(fù)性的檢測。一般廠家的kit需要保證批內(nèi)批間CV%<20%。
8. 線性
樣本經(jīng)梯度稀釋后檢測分析即為線性分析,此過程也是用于消除樣本的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果有假陰性和假陽性兩種,在線性稀釋時(shí)就可以辨別出來,當(dāng)存在基質(zhì)效應(yīng)時(shí)樣本的稀釋線性就不會滿足,說明該類樣本有可能不適用ELISA kit,在研發(fā)階段就需要優(yōu)化反應(yīng)體系等消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的干擾。
9. 回收率
回收實(shí)驗(yàn)可檢測試劑盒是否受干擾因子的影響,也是辨別基質(zhì)效應(yīng)的一種方法。在研發(fā)過程中,一般會采用低、中和高濃度的分析物被摻入到已知濃度的驗(yàn)證樣本中,進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)測定,回收率應(yīng)介于80%-120%,表明試劑盒的性能較好。
10. 穩(wěn)定性
即試劑盒在有效期內(nèi)的穩(wěn)定性。通常采用加速降解的方法來推斷試劑盒的有效期。通常試劑盒在37℃放置一天折合有效期2個(gè)月,實(shí)際工作中,一般將試劑盒在37℃破壞3-7天后,然后檢測上述指標(biāo),觀察是否在范圍內(nèi)。也可留樣至有效期后進(jìn)行檢驗(yàn),來衡量有效期,對于批量大的指標(biāo),可將加速降解和留樣檢驗(yàn)相結(jié)合的方法。
另外,ELISA實(shí)驗(yàn)操作時(shí)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下:
1、嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30~60min。
2、加樣后及時(shí)放人孵箱。標(biāo)本較多時(shí),要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間,防止孵育時(shí)間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗徹di。
3、封板溫育時(shí),各孔一定要封嚴(yán),防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā),產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
4、用洗板機(jī)洗板時(shí),保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板后好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干:還要防止針口有纖維蛋白或異物,這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。
5、合理安排檢測量,以免反應(yīng)板過多造成洗板等待時(shí)間長。
6、加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。
7、顯色劑盡量在臨用前配制,堅(jiān)持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。
8、加樣時(shí)保持顯色劑不外流;A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
9、應(yīng)保證C清潔,整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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