微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。

   當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢査。

   微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。

   如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢査時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對微生物無毒性。

   供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

計(jì)數(shù)方法

   計(jì)數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和zui可能數(shù)法（Most-Probable-Number Method, 簡稱 MPN 法）。MPN 法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，M P N法可能是更適合的方法。

   供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。

計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢査和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

   供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。

   供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。

   若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

菌種及菌液制備

菌種  試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見表1。

菌液制備  按表1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無菌氣化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氣化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人3?5ml含0. 05% (m l/m l)聚山梨酯8 0的pH7_0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氣化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0. 05%(ml/ml)聚山梨酯8 0的pH7. 0 無菌氣化鈉-蛋白胨緩沖液或0. 9%無菌氣化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

   菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8*C，可在2 4小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2?8 ° C ,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

陰性對照

   為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。

培養(yǎng)基適用性檢査

   微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。

   按表1 規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2 管或2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。

   被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1. 供試液制備

   根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45#C 。供試液從制備至加人檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1 小時(shí)。

   常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法。

(1)水溶性供試品   取供試品，用PH7.0無菌氣化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7. 2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1 : 1 0供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步1 0倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

(2)水不溶性非油脂類供試品  取供試品，用pH7. 0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7. 2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1 : 1 0供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0 . 1 %的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H 值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步1 0倍系列稀釋。

(3 )油脂類供試品  取供試品，加人無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與zui少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯8 0或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過4 0 t：(特殊情況下，zui多不超過45°C) ，小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加人預(yù)熱的稀釋液使成1 : 1 0 供試液，保溫，混合，并在zui短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

(4 )需用特殊方法制備供試液的供試品  

膜劑供試品  取供試品，剪碎，加P H 7 .0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或P H 7 .2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1 : 1 0的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液p H 值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品  取供試品，加人P H 6 .8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7. 6 無菌磷酸鹽緩沖液(用于結(jié)腸溶制劑），置45X：水浴中，振搖，使溶解，制成1 : 1 0 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

氣霧劑、噴霧劑供試品  取供試品，置一20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢査。

貼裔劑供試品  取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯8 0或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少3 0分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。

2. 接種和稀釋

   按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇zui低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

(1）試驗(yàn)組  取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每lm l供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于lOOcfu。

(2 )供試品對照組  取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

(3)菌液對照組  取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加人試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

   若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇zui低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對供試%液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加人試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

3 .抗菌活性的去除或滅活

   供試液接種后，按下列“微生物回收” 規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50% ,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。

(1 )增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。

(2 )加人適宜的中和劑或滅活劑。

   中和劑或滅活劑（表2 )可用于消除干擾物的抑菌活性，在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對微生物無毒性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0 .5?2 范圍內(nèi)。

(3 )采用薄膜過濾法。

(4 )上述幾種方法的聯(lián)合使用。

   若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為zui低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢査。

4 .供試品中微生物的回收

   表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或M PN法。

(1 )平皿法  平皿法包括傾注法和涂布法。表1 中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

傾注法 

   取照上述“ 供試液的制備” “ 接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液lm l，置直徑90mm的無菌平皿中，注人15?20ml溫度不超過45*C熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

涂布法

   取15?20ml溫度不超過4 5C的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。

(2)薄膜過濾法  薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性6水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的zui大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

   取照上述“供試液的制備” “ 接種和稀釋” 和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于lg 、lm l或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。

   若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

(3)MPN法  M P N法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用M P N法，按下列步驟進(jìn)行。

   取照上述“供試液的制備” “ 接種和稀釋” 和“ 抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液至少3 個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3 份lm l分別接種至3 管裝有9?10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35°C培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)1?2 天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表3 查被測供試品每l g 或每lm l中需氧菌總數(shù)的zui可能數(shù)。

5. 結(jié)果判斷

   計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0 .5?2 范圍內(nèi)；采用M P N法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

   方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收zui接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢査。