大鼠巨噬細胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒的廠家Elisa試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點，深受廣大用戶朋友的喜愛。然而，在實驗過程中，也需要注意很多問題。對此，篤瑪生物提醒你，需要遵守一些規(guī)則，才能更好地進行實驗，取得較好的實驗成果。 Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。在Elisa測定中影響因素較多，在檢測過程中除正常反應(yīng)外，有時常見到一些錯誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素。
產(chǎn)品名稱：大鼠巨噬細胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒
規(guī)格：48T/孔，96T/孔，提供定量與定性檢測。
保質(zhì)期：6個月，本司保證所售產(chǎn)品均為批次。
特點：靈敏性高、特異性強、重復(fù)性好
用途：科研實驗等領(lǐng)域科學(xué)研究，不得用于臨床診斷。
操作大鼠巨噬細胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
上海篤瑪生物相關(guān)優(yōu)惠產(chǎn)品信息
DMD0583 大鼠鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒
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DMD0588 大鼠硫氧化還原蛋白(Trx)ELISA試劑盒
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大鼠巨噬細胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒操作要點
優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式 ELISA 各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球 ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結(jié)果。
1. 標本的采取和保存
可用作 ELISA 測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物(如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分 ELISA 檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在 ELISA 中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性 HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法 ELISA 中可使本底加深。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫?yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
2. 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用 pH 計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。
3. 加樣
在 ELISA 中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩 1 分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
4. 保溫
在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育， 在 ELISA中似不恰當。ELISA 屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和 4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立 ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在 37℃經(jīng) 1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在 43℃進行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng) 4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在 ELISA 中一般不予采用。
保溫的方式除有的 ELISA 儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將 ELISA 板置于水浴箱中，ELISA 板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA 板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將 ELISA 板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標準室溫溫度是指 20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA 板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
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