細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒齊一生物科技（上海）有限公司是一家專業(yè)生產(chǎn)和銷售各種化學(xué)試劑,生化試劑,醫(yī)藥中間體,標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品的大型化學(xué)科技公司.自公司成立以來,本著始終擁有的創(chuàng)業(yè)激情,公司的銷售額保持高速增長(zhǎng),企業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大.齊一生物科技（上海）有限公司： 60348496.www.qiyibio。。ｃｏｍ

細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
細(xì)胞酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過酪氨酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中底物酪氨酸氧化后，產(chǎn)生多巴色素，呈現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定細(xì)胞裂解懸液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體和動(dòng)物細(xì)胞，尤其是黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞裂解懸液樣品中酪氨酸酶的活性檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶（monophenol monooxygenase），又稱為單酚酶（monophenolase）或單酚 二羥基苯丙氨酸：O2 氧化還原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動(dòng)物組織中，其蛋白結(jié)構(gòu)、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人體酪氨酸酶是一個(gè)跨膜蛋白，而催化結(jié)構(gòu)域在黑色素細(xì)胞（melanocyte）或色素細(xì)胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通過催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羥基化（o-hydroxylation）反應(yīng)變成L-多巴（L-dopamine），進(jìn)而氧化產(chǎn)生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），從而由多巴色素（dopachrome）轉(zhuǎn)化為黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛發(fā)和眼睛色素。紫外線可以激活酪氨酸酶活性，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)引起色素沉著（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突變將導(dǎo)致I型眼皮膚白化?。╫culocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制劑成為增白化妝品的重要元素?；诘孜锢野彼?，在酪氨酸酶的催化下，產(chǎn)生多巴色素，通過其吸光值的變化（475nm波長(zhǎng)），來定量測(cè)定酪氨酸酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A）                                    毫升
裂解液（Reagent B）                                    毫升
緩沖液（Reagent C）                                 毫升
底物液（Reagent D）                                 毫升
陰性液（Reagent E）                                     微升
產(chǎn)品說明書                                                  1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后進(jìn)行下列操作。
一、樣品準(zhǔn)備 
1．準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（15 X 106細(xì)胞）
2．小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
3．小心抽去清理液
4．使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
5．加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
6．移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
7．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12．置于冰槽里孵育30分鐘
13．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1.準(zhǔn)備好上述待測(cè)樣品，置于冰槽里
2.設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)475nm 
3.緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、背景對(duì)照測(cè)定
1．移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升底物液（Reagent D）
3．充入氧氣2分鐘
4．加入xx微升陰性液（Reagent E）
5．上下傾倒數(shù)次，混勻
6．室溫下（25℃）孵育60分鐘
7．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景讀數(shù)
四、樣品測(cè)定
1.移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿 
2.加入xx微升底物液（Reagent D）
3.充入氧氣2分鐘
4.加入50微升待測(cè)樣品（注意：50微克蛋白總量）
5.上下傾倒數(shù)次，混勻
6.室溫下（25℃）孵育60分鐘
7.即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)
五、計(jì)算樣品活性
 六、酶標(biāo)板測(cè)定
1．在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2．分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到所有孔中
3．分別加入xx微升底物液（Reagent D）
4．充入氧氣2分鐘
5．分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（50微克蛋白總量）
6．輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
7．室溫下（25℃）孵育60分鐘
8．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，獲得背景和樣品讀數(shù)
9．活性計(jì)算
注意事項(xiàng)
1．本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照
2．操作時(shí)，須戴手套
3．系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次
4．測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定持續(xù)60分鐘 
5．比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
6．樣本讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性
7．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1） 
8．如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
9．可以使用酪氨酸酶抑制劑曲酸（Kojic acid）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
10．酪氨酸酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化產(chǎn)生1 微摩爾多巴色素所需的酶量作為一個(gè)活性單位
11．本公司提供系列酪氨酸酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感