組織氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑盒

組織氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑盒齊一生物科技（上海）有限公司以真誠(chéng)、主動(dòng)、周到、規(guī)范、熱情的服務(wù)很快得到廣大客戶的*好評(píng).公司秉承“適應(yīng)多樣化的需求,提供專業(yè)化的服務(wù)”的經(jīng)營(yíng)理念,為客戶提供*的服務(wù).歡迎社會(huì)各界朋友前來(lái)洽談業(yè)務(wù),共創(chuàng)輝煌！齊一生物科技（上海）有限公司： 60348496.www.qiyibio。。ｃｏｍ

組織氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途
組織氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧化，進(jìn)而與偶氮染料反應(yīng)，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，由分光光度儀比色分析未反應(yīng)棕色成分，來(lái)定量檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)羥自由基活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）裂解懸液的羥自由基檢測(cè)，以及羥自由基激發(fā)劑和抗氧化清除劑（scanvenger）等的檢測(cè)?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應(yīng)性和毒性，同時(shí)半衰期短（10－910－10秒）。其產(chǎn)生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過(guò)氧化物和次氯酸反應(yīng)、過(guò)氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物偶氮亞砜（diazosulfone），通過(guò)分光光度儀（325nm波長(zhǎng)），檢測(cè)未反應(yīng)棕色成分，以測(cè)定羥自由基的含量。據(jù)此證明組織細(xì)胞內(nèi)活性氧族的存在。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A）                                   毫升
標(biāo)記液（Reagent B）                                   微升
酸性液（Reagent C）                                   微升
染色液（Reagent D）                                   瓶
終止液（Reagent E）                                   毫升
萃取液（Reagent F）                                   毫升
標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）                                   毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書                                               x1份
保存方式
保存染色液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，注意密閉；染色液（Reagent D）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器
2毫升離心管：用于樣品操作的容器
DOUNCE勻漿器：用于組織細(xì)胞裂解
臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備和反應(yīng)處理
石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器
分光光度儀：用于比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
 一、樣品準(zhǔn)備 

1．手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
2．（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入到一個(gè)液氮凍存管
5．即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6．次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
7．放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
8．加入xx毫升清理液（Reagent A）
9．強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
10．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
11．在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
12．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
13．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為10000g
14．小心移取3毫升上清液到新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
15．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制
1．準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為15號(hào)管
2．分別加入xx微升清理液（Reagent A）到25號(hào)管
3．移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到1號(hào)管
4．小心移取xx微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2號(hào)管，混勻
5．小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到3號(hào)管，混勻
6．小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到4號(hào)管，混勻
7．將15號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

管號(hào)    清理液（Reagent A）    標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）    測(cè)定體系標(biāo)準(zhǔn)MSA濃度
1    －    xx微升    xx微摩爾/升
2    xx微升    xx微升1號(hào)管    xx微摩爾/升
3    xx微升    xx微升2號(hào)管    xx微摩爾/升
4    xx微升    xx微升3號(hào)管    xx微摩爾/升
5    xx微升    0    0

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出xx毫升清理液（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，標(biāo)記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用12次）。 放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作
1．移取xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到2毫升離心管
2．加入xx微升酸性液（Reagent C）
3．加入xx微升染色工作液，手動(dòng)混勻
4．室溫下孵育10分鐘，避免光照
5．加入xx微升終止液（Reagent E），手動(dòng)混勻
6．加入xx毫升萃取液（Reagent F），手動(dòng)混勻
7．小心移取1毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
8．即刻（3分鐘內(nèi)）放進(jìn)分光光度儀（325nm波長(zhǎng)）檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
9．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟18四次
10．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)MSA濃度（微摩爾/升）

四、樣品測(cè)定

1．移取200微升待測(cè)樣品到2毫升離心管
2．加入xx微升標(biāo)記液（Reagent B）
3．渦旋震蕩5秒
4．室溫下孵育30分鐘
5．加入xx微升酸性液（Reagent C）
6．加入xx微升染色工作液，手動(dòng)混勻
7．室溫下孵育10分鐘，避免光照
8．加入xx微升終止液（Reagent E），手動(dòng)混勻
9．加入xx毫升萃取液（Reagent F），手動(dòng)混勻
10．小心移取1毫升上層淺棕色液相到新的比色皿
11．即刻（3分鐘內(nèi)）放進(jìn)分光光度儀（325nm波長(zhǎng)）檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
12．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
13．計(jì)算樣品實(shí)際MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
14．或構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)活性氧生成曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為羥自由基活性氧吸光值（OD）；橫坐標(biāo)（X軸）為組織量、蛋白量、時(shí)間點(diǎn)或藥物處理濃度等
注意事項(xiàng)
1．本產(chǎn)品為20次操作
2．操作時(shí)，須戴手套
3．酸性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
4．終止液（Reagent E）和萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，注意密閉
5．建議染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用為佳
6．孵育時(shí)，必須避免光照
7．建議使用新鮮樣品
8．建議使用石英或玻璃比色皿
9．本產(chǎn)品適合抗氧化能力檢測(cè)
10．用戶可以使用320360nm之間的任一波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)
11．如果讀數(shù)大于1.5，可以使用萃取液（Reagent F）予以稀釋，但注意計(jì)算公式的稀釋倍數(shù)變化
12．本公司提供系列氧化應(yīng)急活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2．本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感
使用承諾
“信譽(yù)上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。