Invitrogen 脂質(zhì)體2000 昱都生物*相關(guān)產(chǎn)品如下Invitrogen TRIzol試劑 0.75ML和1.5ML;Invitrogen 17504044 B-27(黃顏色) 10ML;12587010 B-27 (黃顏色)不含維生素A 10ML;17502048 N-2 (粉紅顏色) 5ML。
Invitrogen 脂質(zhì)體2000
貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 |
11668027 | 脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑 | 0.75ML | 1600 |
11668019 | 脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑 | 1.5ML | 2200 |
我們介紹一下的操作流程、注意事項(xiàng)等。
一、操作流程
事實(shí)上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單:稀釋DNA以及Lipofectamine 2000,混合2種稀釋液保溫20分鐘,加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育24-96小時(shí)檢測結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細(xì)流程和注意事項(xiàng)。
1、轉(zhuǎn)染前一天,胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),細(xì)胞鋪板,使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。
2、對(duì)于每孔細(xì)胞,使用50μl無血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋0.8μg-1.0μg DNA。3、對(duì)于每孔細(xì)胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘(在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時(shí)間過長會(huì)降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋,細(xì)胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液,必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。
4、混合稀釋的DNA(第2步)和稀釋的Lipofectamine 2000(第3步)。在室溫保溫20分鐘。 注意:溶液可能會(huì)混濁,但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時(shí)穩(wěn)定。
5、直接將復(fù)合物加入到每孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板,輕輕混勻。注意:如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染,使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基,替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基。
6、在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時(shí),無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時(shí)后更換生長培養(yǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。
7、在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后,分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色,檢測報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá),在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中,兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。
8、對(duì)于96孔板培養(yǎng),不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板,而可以直接在平板中制備復(fù)合物,然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了,這樣進(jìn)一步減少了轉(zhuǎn)染時(shí)間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過293-H,293-F,COS-7L和CHO細(xì)胞的試驗(yàn),同傳統(tǒng)方法相比活性稍低??旖莸牟襟E和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染,比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時(shí)表達(dá)。