產(chǎn)品名稱：FlashPfu DNA 聚合酶
英文名稱：FlashPfu DNA Polymerase
FlashPfu DNA 聚合酶價格產(chǎn)品規(guī)格：
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品價格 |
TB10011A | 100 U | ￥990 |
TB10011B | 250U | ￥1690 |
FlashPfu DNA 聚合酶價格產(chǎn)品描述：FlashPfu 高保真DNA 聚合酶通過融合特殊持進(jìn)能力增強(qiáng)因子與精心改造過的pfu DNA聚合酶，是來源于超嗜熱古細(xì)菌的DNA聚合酶。該酶具有5'→3' 聚合酶活力, 3'→5' 核酸外切酶活力，并產(chǎn)生平頭末端產(chǎn)物。由于其具有高效的3'→5' 核酸外切酶活力（校正活力），使得PCR能獲得很好的保真性，F(xiàn)lashPfu DNA聚合酶的錯配率約為Taq DNA聚合酶的1/50。FlashPfu DNA聚合酶的zui快延伸速率可達(dá)5−6 kb/min，對于復(fù)雜模板也可達(dá)到2 kb/min。
特點(diǎn)與應(yīng)用：
1、高保真PCR——保真性為Taq DNA聚合酶的50倍
2、快速PCR——延伸速度15−30 s/kb
3、長片段PCR——基因組DNA ≤ 19 kb，λ DNA ≤ 30kb
4、生成用于平頭末端克隆的PCR產(chǎn)物
5、定點(diǎn)突變
活力單位定義：75°C、30分鐘內(nèi)使10 nmol的dNTP摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量，定義為1個活性單位（U）。
儲存條件：儲存于-20℃。
注意事項(xiàng)：
1、請等2× FlashPfu PCR Buffer (with Mg2+)*溶解后再配制PCR反應(yīng)體系。
2、為了獲得的擴(kuò)增效果，擴(kuò)增前的所有操作請在冰上進(jìn)行。在室溫下，聚合酶活力可能會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。并且請將FlashPfu DNA Polymerasezui后加入反應(yīng)體系，以避免酶的3’→5’核酸外切酶活力導(dǎo)致引物降解。
3、本產(chǎn)品擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆請按照平頭末端克隆方法操作。
4、引物設(shè)計：
1）引物Tm值計算請使用zui鄰近法。請不要使用其他計算方法，它們計算得到的Tm值偏低，不適合本產(chǎn)品。
2）引物長度控制在20−35堿基，并且Tm > 60°C。
3）引物的GC含量盡量控制在40−60%。
4）在引物3’端以G或C結(jié)尾，可提高引物和模板結(jié)合效率。但是要避免3’端避免有多個G或C，防止非特異性結(jié)合。
5）正、反引物的Tm之差不要大于5°C。
6）正、反向引物的3’端避免相互互補(bǔ)。
7）擴(kuò)增長片段時，引物長度控制在25−35堿基。
8）進(jìn)行定點(diǎn)突變時，請將錯配堿基靠近5’端。若錯配堿基靠近3’端，可能會受本酶校正。
不要使用含有尿嘧啶和次黃嘌呤核苷的引物。
應(yīng)用舉例：對于復(fù)雜模板的極限延伸速度
步驟1. 按下表所示，在50 µl PCR體系中加入100 ng人基因組：
成分 | 體積 | 終濃度 |
2× FlashPfu PCR Buffer (with Mg2+) | 25 μl | 1× |
2.5 mM dNTP | 4 μl | 0.2 mM each |
10 μM Forward Primer | 2.5 | 0.5 μM |
10 μM Reverse Primer | 2.5 | 0.5 μM |
FlashPfu DNA Polymerase | 1.0 μl | 1 U |
Nuclease-free water | To 50 μl |
|
100 ng/μl human genomic DNA | 1 μl | 100 ng/50 μl |
步驟2. 設(shè)置PCR程序：
2步法 | |||
步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
預(yù)變性 | 98°C | 3 min | 1 |
變性 | 98°C | 10 sec | 30 |
延伸 | 72°C | X min | |
延伸時間:
X= 1 min (10 s/kb)
1.5 min (15 s/kb)
2 min (20 s/kb)
3 min (30 s/kb)
該案例中所用的引物：
6 kb β-globin target
FP: ACAAGGGCTACTGGTTGCCGATTTTTATTG
RP: GGGACTGGCCTCAGAGGAAACTTCAGG
案例結(jié)果電泳圖：
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