反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
產(chǎn)品名稱 | 絮狀表皮癬菌PCR檢測試劑盒供應(yīng)商 |
英文名稱 | Epidermophyton floccosumPCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點:
高特異性:與其他病毒無交叉反應(yīng),無非特異性擴(kuò)增;
高靈敏度:檢測靈敏度可達(dá)10~100;
操作簡便:該系列所有試劑均采用相同的體系和條件,可同時進(jìn)行多個檢測;
高通量:多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。
樣品 DNA 的制備:
1.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝(一管式病毒 DNAout 的成分)。
稀釋陽性對照(以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DNA 片段作為陽性對照。
2.標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭,在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中,得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
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使用及效果:
PCR反應(yīng)特點
(1) 特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
(2) 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個細(xì)菌。
(3) 簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
(4) 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活PCR技術(shù)概論。
CD146/MCAM抗體,鼠單抗 63-37-6 100mg 0.997ELISA IP 胞苷-5'磷酸
ELISAKitforHumanCollagenalpha-1(II)chain34539-65-6 20mg β, β-dimethyl-acry-lalkannin 0.625-40 ng/mLβ,β’-二基丙酰阿卡寧
CarboxypeptidaseB1/CPB1抗體,鼠單抗158800-83-0A0725IHC-P 七葉皂苷D
人成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF-23)ELISA試劑盒158196-34-010mg Naringenin-7-O-glucuronide
78-5000 pg/mL柚皮素-7-O-葡萄糖酸苷
ADK抗體,兔多抗,抗原親和純化115939-25-8C36H30O16Salvianolic acid B≥98%ELISA WB 丹酸B
ELISAKitforHumanLamin-B125ML 0.78-50 ng/mL1-丁-3- 1-Buten-3-ol >97.0%(GC)
吖啶黃素(2.5mg/支)25g 1ml/支*5Crystal violet 結(jié)晶紫
人組織蛋白酶G(CTSG)ELISA試劑盒126054-77-1 20mg Atractyloside A 0.156-10 ng/mL蒼術(shù)苷A
苯胺藍(lán)-DNA酶瓊脂/ToluidineBlue-O-DnaseAgar24307-26-4wako 24307-26-4 子起生物
ELISAKitforHumanTransmembraneproteaseserine45mg 0.78-50 ng/mL基補(bǔ)骨脂黃 A BAVACHININ A(SH)
人結(jié)腸成纖維細(xì)胞 20mg HPLC≥98%Baicalein用于含量測定1 x 10^6 cells/T25培養(yǎng)瓶黃芩素;黃芩苷元; 黃芩黃素; 5,6,7-三羥基黃
GFRA2抗體,兔多抗1gELISA 胭脂紅酸 CARMINIC ACID(RG)
人解整合素樣金屬蛋白酶33(ADAM33)ELISA試劑盒3681-93-4 20mgVitexin HPLC≥98% 0.312-20 ng/mL牡荊素;牡荊黃素;牡荊苷
EGF/EpidermalGrowthFactor中和抗體87701-68-6HPLC≥98%A048020mg/支B/N 環(huán)氧澤瀉
漢坦病毒Ⅱ型(HTV-Ⅱ)核酸檢測試劑盒(RT-PCR法)28808-62-0 20mgFraxinellone HPLC≥98% 15.6-1000 pg/mL梣;岑
CD300A抗體,鼠單抗57378-72-0C25H24O12Isochlorogenic acid C(4,5)≥98%FCM 異綠原酸C
絮狀表皮癬菌PCR檢測試劑盒供應(yīng)商人參二 HPLC≥98% A0250 TransferrinReceptor/TFRC/CD71抗體(PE),鼠單抗 20mg/支
大豆苷 20mg Daidzin 副溶血性弧菌(VP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) HPLC≥98%
(+)-松脂素-β-D-葡萄糖苷 10mg (+)-Piresil-4-O-β-D-glucopyraside ELISAKitforHumanGlutamatedehydrogenase1,mitochondrial
大豆苷元 C15H10O4 Daidzein BLVRB/biliverdinreductaseB抗體,兔單抗 ≥98%
二乙二丁醋酸酯 1mL 0.994 VLDLR/VLDLReceptor抗體,鼠單抗
NADP Na2 型輔酶Ⅱ 100mg Mueller-Hinton瓊脂(MHA)
Wako 146-08751 Nateglinide 146-08751 牛肉浸粉
橙黃決明素 20mg Aurantio-obtusin ELISAKitforHumanCollectin-11