人血管生成素相關(guān)生長因子AGF

 

 

 

自備物品 1.酶標(biāo)儀（盡量提前預(yù)熱） 2.微量加液器、吸頭 3.蒸餾水或去離子水以及濾紙
操 作 步 驟
1. 取出試劑盒，于室溫（20-25℃）放置15-30分鐘。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在室
溫（20-25℃）內(nèi)進(jìn)行。
2. 取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。
3. 空白微孔中加入100μl的樣品，空白對照加入100μl的蒸餾水；
4. 在各孔中加入50μl的酶標(biāo)記溶液；（不含空白對照孔）
5. 將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng) 1小時；（在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度）
6. 充分清洗酶標(biāo)板3-5次，保持各孔有充足的水壓；（濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋）
7. 酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙*拍干；
8. 各孔加入顯色劑A、B液各50μl；（不含空白對照孔）
9. 20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘；
10. 各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)；
結(jié) 果 判 斷
1. 30分鐘內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值； 2. 百分結(jié)合率計(jì)算：設(shè)S0管計(jì)數(shù)為B0，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計(jì)數(shù)為B，非特異管計(jì)數(shù)為NSB，則百分結(jié)合率計(jì)算公式如下：B/ B0=（B－NSB）/（ B0－NSB）×* 3. logit計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)或樣品管的logit值計(jì)算公式如下:logit=ln（B/ B0）/（1－B/ B0）
4. 將標(biāo)準(zhǔn)品的OD均值與標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)的OD均相除，為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的百分結(jié)合率，在log-logit坐標(biāo)紙上繪圖。
5. Log-logit雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：坐標(biāo)紙上橫軸從左至右*個1-9表示為*個10進(jìn)位，第二個1-9表示為第二個10進(jìn)位。第三個1-9表示為第三個10進(jìn)位。坐標(biāo)紙縱軸為百分比（1-99），即各標(biāo)準(zhǔn)吸光值的百分結(jié)合率。取一條通過各點(diǎn)的直線。要求盡可能多的點(diǎn)在線上，同時剩余的點(diǎn)均勻分布在直線的兩邊。樣品也同樣由吸光值計(jì)算百分結(jié)合率，再從縱軸上的相應(yīng)結(jié)合率找到直線上的點(diǎn)，此點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度即為樣品的濃度，無須換算。