雞傳染性支氣管炎抗體檢測試劑盒
使用說明書
【用途】
用來檢測雞血清中的禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）抗體
【試驗原理】
臨床上，傳染性支氣管炎是一種急性、高度傳染的病毒性疾病，任何日齡的雞都可以感染。IBV的潛伏期為24-72小時。疾病侵害雞的呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)。青年雞表現(xiàn)為急性呼吸道癥狀及氣管損傷。死亡率可高達(dá)100%。血清中的病毒抗體可通過酶聯(lián)免疫的方法檢測。血清中的IBV抗體水平及整個雞群的免疫狀況可用ELISA方法進(jìn)行監(jiān)測。
將滅活的抗原包被在微孔板上，加入稀釋后的血清并孵育，血清中的抗IBV抗體將與包被在微孔板上的IBV結(jié)合，形成IBV抗原-抗體復(fù)合物。然后洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗雞IgG的酶標(biāo)結(jié)合物至微孔板中，酶標(biāo)物將與IBV抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合。孵育后洗掉未結(jié)合的結(jié)合物，然后加入底物溶液。底物與堿性磷酸酶反應(yīng)并生成一種黃色的產(chǎn)物，zui后終止反應(yīng)，將顏色固定。顏色的深淺可用酶標(biāo)儀（405-410nm）測定。
【一個微孔板所需的試劑的量】
| 抗原包被微孔板 | 12×8條（板） |
| 樣品稀釋液（1×） | 120ml |
| 洗滌液（1×） | 500ml |
| 陽性對照 | 2μl |
| 陰性對照 | 2μl |
| 結(jié)合物 | 12ml |
| 底物液 | 12ml |
| 終止液 | 12ml |
【所需物品】
1. 能夠吸取2μl、100μl和800μl的精確移液器
2. zui大吸取100μl的多通道移液器
3. 計時器
4. 量筒
5. 蒸餾水
6. 洗板機(jī)
7. 稀釋用容器
8. 能夠讀雙波（405-410nm和630-650nm）的酶標(biāo)儀，OD值讀數(shù)zui大可達(dá)到3.0
【樣品收集】
采集至少0.5ml全血，分離血清并放在冰箱里，2-7℃用于短期儲存，如果長期儲存，應(yīng)冷凍，且避免反復(fù)凍溶。如果樣品含有可見的顆粒物質(zhì)，應(yīng)在檢測之前將其離心除去，嚴(yán)重污染的樣品不允許使用（如高度渾濁、細(xì)菌污染等）
【結(jié)果計算】
將陽性對照吸光度值和樣品吸光度值分別減去陰性對照吸光度值，注意：對照品及樣品吸光度值都應(yīng)該是2個重復(fù)孔的平均值。每個樣品的計算式如下：
| 樣品平均吸光度值 － 陰性對照吸平均吸光度值 | ＝樣品與陽性對照比值（Sp） |
| 陽性對照平均吸光度值 － 陰性對照平均吸光度值 |
Sp ×（100）＝ ELISA Unit （EU） 陽性對照值設(shè)為100 EU
【結(jié)果判定及EU單位說明】
IBV ELISA 值 說明
小于10EUs IBV抗體為陰性
10-15 EUs IBV抗體為弱陽性，應(yīng)被認(rèn)為經(jīng)過免疫或暴露于IBV，油乳狀疫苗也可能引起非特異性低水平抗體。
15-75 EUs IBV抗體適度陽性
＞75 EUs IBV抗體強(qiáng)陽性
【操作步驟】
1. 將試劑回溫至室溫，通過顛倒和渦旋將試劑混勻。
2. 將1份4×樣品稀釋液加入到含3份去離子水的容器中，充分混勻，例如，30ml 4×樣品稀釋液加入到90ml去離子水中。
3. 將1份20×洗滌液加入到含19份去離子水的容器中，充分混勻，例如，25ml 20×洗滌液加入到475ml去離子水中。
4. 稀釋前將陽性對照、陰性對照和樣品震蕩均勻。
5. 陽性對照、陰性對照和樣品均需要用樣品稀釋液稀釋后使用。稀釋比例為2μl ：800μl。將移液器調(diào)到100μl，反復(fù)吹打4次使之充分混勻。
6. 將稀釋后的陰性對照、陽性對照分別加入微孔中，每種做兩個平行，每孔100μl；將稀釋后的樣品100μl分別加入孔中，室溫下靜置30分鐘。
7. 棄去微孔板中溶液，每孔加入300μl洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌2次，在洗滌過程中防止酶標(biāo)板變干。
8. 每孔立即加入100μl結(jié)合物，室溫靜置30分鐘。
9. 重復(fù)步驟7進(jìn)行洗板。
10. 每孔立即加入100μl底物，室溫靜置30分鐘。
11. 不要倒掉板內(nèi)液體，每孔立即加入100μl終止液。
12. 用酶標(biāo)儀雙波讀數(shù)（405nm或410nm作為主要波長，630nm或650nm為參考波長），計算結(jié)果。
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