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上海炎熙生物科技有限公司
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超全熒光定量PCR應(yīng)用常見問題匯總！2024/11/11
實時熒光定量技術(shù)是什么20世界90年代由美國AppliedBiosystems公司推出實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timeqPCR），其基本原理是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光染料探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程。熒光定量PCR最大的優(yōu)勢可以對初始模板進行定量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。常見問題羅列沒有CT值實驗結(jié)果一旦遇到?jīng)]有Ct值情況，就要在第一時間排查是否有以下問題：（1）循環(huán)數(shù)不夠（但是一般不超過45循環(huán)，不僅背景值提高，定量也不準(zhǔn)）；（2）PCR
PCR擴增的抑制劑有哪些？2024/10/02
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加，能將皮克(pg）量級的起始待測模板擴增到微克（μg）水平?？梢詮?00萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。所以無論是化石中的古生物，歷史人物的殘骸，還是案發(fā)現(xiàn)場殘留的毛發(fā)皮膚或血液，都能用PCR加以放大進行比對，這也是“微量證據(jù)”的威力所在。但是從各種生物檢材中提取的DNA，其中多含有能干擾PCR的抑制物，是DNA檢測失敗的重要原因之
干貨：如何增加PCR特異性？2024/09/09
引物設(shè)計細(xì)心地進行引物設(shè)計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：①典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨-特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。②選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像
融解曲線中那些令你頭疼的問題2024/08/26
融解曲線中那些令你頭疼的問題，全面解析看這里！我們在做染料法SYBRGreenqPCR時，除了要看擴增曲線的CT值大小外，另一個重要的指標(biāo)是融解曲線是否為單峰。那您知道融解曲線是怎么來的嗎？為什么說它是染料法SYBRGreenqPCR的重要指標(biāo)之一呢？我們現(xiàn)在就來一起了解一下。01，什么是融解曲線要明確融解曲線的重要性，我們需要先知道染料法SYBRGreenqPCR的化學(xué)原理。染料法SYBRGreenqPCR的體系中添加了一種DNA雙鏈小溝結(jié)合染料,即SYBRGreen。它與DNA結(jié)合時發(fā)光，游
細(xì)胞支原體污染的檢測方法2024/08/19
培養(yǎng)的細(xì)胞可能會污染支原體，支原體是一種常見的細(xì)菌，它可以在實驗室環(huán)境中生長和繁殖。如果實驗操作不當(dāng)，可能會導(dǎo)致支原體污染細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，一些細(xì)胞系可能已經(jīng)被感染了支原體，一些培養(yǎng)用的試劑也可能帶有支原體。由于支原體體積很小，可以穿過0.22um的無菌過濾膜，且通過常規(guī)顯微鏡觀察很難發(fā)現(xiàn)，因此常在不知不覺中傳播。為了避免支原體污染，實驗室應(yīng)該采取嚴(yán)格的操作規(guī)范和消毒措施，并且對所用的細(xì)胞和各種試劑進行檢測，以確保細(xì)胞培養(yǎng)物的純度和質(zhì)量。以下是一些檢測細(xì)胞污染支原體的方法：一，體外培養(yǎng)法：培養(yǎng)法
衣原體檢測的方法及優(yōu)缺點2024/07/29
衣原體屬于原核生物，嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，是一種比細(xì)菌小比病毒大的微生物，能通過細(xì)胞濾器，有特殊的兩相發(fā)育周期。它沒有合成高能化合物ATP、GTP的能力，必須由宿主細(xì)胞提供，因而必須依靠寄生才能生存。衣原體的致病機理是抑制被感染細(xì)胞的代謝，溶解破壞細(xì)胞并導(dǎo)致溶解酶釋放，代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒作用引起變-態(tài)反應(yīng)和自身免疫。衣原體感染可引起子宮感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)、尿道感染、肺炎、支氣管炎、胃腸炎、腦脊髓炎、結(jié)膜炎和關(guān)節(jié)炎等多種疾病。衣原體檢測的方法主要有以下幾種：1.PCR檢測法：利用PCR技術(shù)擴增衣原體的DNA
常見測蛋白濃度方法的優(yōu)缺點比較2024/07/20
蛋白濃度測定的方法有很多，但每種方法都有其特點和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測試則不太合適；Lowry法精確度較高，但是比較費時，且每步的時間要求相對嚴(yán)格；Bradford法靈敏簡便，但易受去垢劑的影響；BCA法以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力強，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受歡迎。在蛋白濃度測定中，以下面四種方法為常見：1.Bradford法：原理：在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G250染料，導(dǎo)致染
測序揭示與干眼癥有關(guān)的眼部微生物組差異2024/04/26
研究人員使用測序技術(shù)來確定健康眼睛患者的微生物組合與干眼癥患者的微生物組合有何不同。這項新研究可能會改善各種眼部問題和影響身體其他部位疾病的治療方法。我們體內(nèi)和體表的微生物群落;統(tǒng)稱為人體微生物群-;對保持我們的健康起著至關(guān)重要的作用。雖然許多研究都集中在我們腸道中的微生物群落，但了解存在于身體其他部位的微生物群對于提高我們對人類健康的認(rèn)識和制定有針對性的疾病預(yù)防和治療干預(yù)措施至關(guān)重要。VanKley實驗室的研究生PallaviSharma在2024年3月23日至26日在圣安東尼奧舉行的美國生物
細(xì)說Western Blot2023/10/19
與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白
染料法和探針法熒光定量PCR（RT-qPCR）的優(yōu)缺點比較2023/10/18
一、熒光染料法(SYBRGreen)其原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入過量熒光染料，DNA擴增的過程中，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，發(fā)射熒光信號，隨著反應(yīng)的進行，熒光強度逐漸增強，并且可以實時測量。如果你要擴增你的目標(biāo)樣品40個循環(huán)，在最后一個循環(huán)結(jié)束時檢測到的熒光會比在第10個循環(huán)測得的熒光強很多。優(yōu)點：1、成本較低，適合大規(guī)模的實驗。2、在實驗設(shè)計階段非常省時，因為它只需要合適的引物設(shè)計。缺點：1、特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產(chǎn)物。2、如果引物二聚體
Bradford實驗的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的嗎？2023/07/07
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法）測蛋白濃度，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白定量方法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，操作簡便，反應(yīng)迅速且穩(wěn)定，靈敏度高，干擾因素少，因而得到廣泛的應(yīng)用。其原理是：考馬斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，形成的復(fù)合物顏色深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)
熒光定量 PCR 要點解析2023/06/27
一、熒光定量PCR原理熒光定量PCR（Real-timePCR），是指在PCR擴增反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過對擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬
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