?HEK293 細(xì)胞及其種類
人胚胎腎細(xì)胞系(Human Embryonic Kidney, HEK293)的起源可追溯至1973年，因轉(zhuǎn)染了人5型腺病毒(Ad5)DNA片段而成為了永生化細(xì)胞系，約4Kb的Ad5基因組(包含E1A和E1B基因)被整合進(jìn)入HEK293的19號染色體上。隨后，科研人員在HEK293原代細(xì)胞系上又相繼衍生出多種不同的HEK293細(xì)胞系，用于不同方向的研究和應(yīng)用。主要包括：HEK293、HEK293T、HEK293E、HEK293F、 HEK293S、HEK293SG、和HEK293H等(如圖1)【1】。
圖1 常見的不同商業(yè)化HEK293細(xì)胞系
?HEK293 細(xì)胞系的特點(diǎn)及應(yīng)用
CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Sp2/0等哺乳動(dòng)物細(xì)胞常被用于制備生物制藥。然而這些小鼠來源的細(xì)胞與HEK293細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白相比，翻譯后的修飾存在差異。不同的修飾可能會(huì)直接影響蛋白的生物活性、半衰期、免疫原性等多種功能。HEK293細(xì)胞系除了具有人源的翻譯后修飾能力，還具有其他許多優(yōu)勢：
1.在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的能力；
2.對多種轉(zhuǎn)染方式的兼容性；
3.快速分裂與表達(dá)等。
這些HEK293細(xì)胞系的優(yōu)異特性也一直吸引著科研人員不斷探索，如今HEK293及其衍生細(xì)胞系已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和生物制藥行業(yè)中，HEK293對于病毒易感性也使得它成為生產(chǎn)流感病毒、慢病毒、重組腺病毒和重組腺相關(guān)病毒的載體。目前，已有多款基于HEK293細(xì)胞的產(chǎn)品獲批在歐洲和美國上市(如圖2)【2】。
圖2 基于HEK293細(xì)胞的上市產(chǎn)品示例
?HEK293 細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)化
HEK293細(xì)胞培養(yǎng)中會(huì)涉及到原材料、設(shè)備和技術(shù)等多方面的影響。
1.原材料: 主要包括培養(yǎng)基、消化劑、微載體等。目前，各政府或全球相關(guān)組織的法規(guī)制度對產(chǎn)品的安全性要求越來越高，所以更多的生產(chǎn)商會(huì)選擇使用無動(dòng)物源成分(ADCF)的培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)。
2.設(shè)備: 大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞一般會(huì)需要用到WAVE反應(yīng)器和生物反應(yīng)器兩種，因此需要兩種反應(yīng)器對于pH、溶氧(DO)、二氧化碳(CO2)、溫度、壓力、通氣氣泡大小、轉(zhuǎn)速等的控制和監(jiān)測要求比較高。百林科作為生物制藥工藝核心解決方案供應(yīng)商，致力于為生物制藥企業(yè)提供更高效趁手的工具，從而助力藥物的發(fā)展和創(chuàng)新。由百林科自主研發(fā)生產(chǎn)的CytoLinX® WB 系列一次性波浪式生物反應(yīng)器，采用先進(jìn)的 PID 反饋控制技術(shù)和光纖電極光補(bǔ)償技術(shù)，可進(jìn)一步助力生物制藥企業(yè)提高細(xì)胞培養(yǎng)工藝的穩(wěn)定性和可靠性：
CytoLinX® WB 系列一次性波浪式生物反應(yīng)器
CytoLinX® WB具備以下優(yōu)勢
精準(zhǔn)控制
通過精準(zhǔn)的檢測及反饋調(diào)節(jié)功能，進(jìn)行準(zhǔn)確的溫度、轉(zhuǎn)速、PH、DO等參數(shù)控制，并且可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程的多方位監(jiān)控和數(shù)據(jù)采集，更適合HEK293細(xì)胞培養(yǎng)。
低剪切力
輕柔的波浪式搖擺，將對細(xì)胞的剪切力降低，減少對細(xì)胞造成的損傷。
托盤可切換
設(shè)備托盤可方便置換 10L，20L，50L培養(yǎng)袋，無需拆擰螺絲，簡單快速完成培養(yǎng)袋安裝操作。
灌流功能
支持灌流功能，泵流速具有自動(dòng)校準(zhǔn)功能，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)補(bǔ)料及收獲。
密閉系統(tǒng)
減少外源性污染的風(fēng)險(xiǎn)。
一次性無菌耗材
采用預(yù)先輻照滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)袋，杜絕污染風(fēng)險(xiǎn)，有效避免反應(yīng)器的清洗和驗(yàn)證，縮短工藝開發(fā)和生產(chǎn)周期。
同時(shí)，百林科提供的CytoLinX® WB 系列一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋專為生物制藥常見的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用設(shè)計(jì)，可匹配百林科或者市場上其他主流供應(yīng)商的波浪式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使用。
工作體積：300 mL-25 L
3. 培養(yǎng)技術(shù)：培養(yǎng)技術(shù)的提升一般需要積累的經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞的培養(yǎng)、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和提升重組蛋白表達(dá)策略等幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化的簡介。
a) 細(xì)胞的培養(yǎng)
傳代過程中首先要避免支原體及其他污染。培養(yǎng)基可根據(jù)不同細(xì)胞系和法規(guī)選擇不同 的類型。培養(yǎng)過程中根據(jù)DoE摸索細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度、轉(zhuǎn)速、pH、DO濃度、CO2濃度、氣泡大小、灌流參數(shù)等條件并建立SOP。
b) 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
生產(chǎn)中細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用的轉(zhuǎn)染試劑為線性化聚乙烯亞胺(Polyethylenimine Linear, PEI)，濃度1mg/mL。一般推薦PEI:DNA的比例為1:1到3:1之間。
c) 提升重組蛋白表達(dá)量的策略
一般表達(dá)重組蛋白時(shí)，總會(huì)有一些重組蛋白的表達(dá)量很低，導(dǎo)致成本增加，純化困難。遇到這種情況，我們可以選擇優(yōu)化目的蛋白的密碼子；在目的基因ATG前面加入Kozak序列(GCCACC)促進(jìn)mRNA轉(zhuǎn)錄；優(yōu)化信號肽和跨膜區(qū)(如果有的話)；DoE摸索表達(dá)時(shí)間和轉(zhuǎn)染劑量；細(xì)胞存在異質(zhì)性，可通過篩選單克隆以篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。
?HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)案例分享
HEK293細(xì)胞培養(yǎng)工藝路線為：
搖瓶擴(kuò)增→接種至WB反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。
每日取樣檢測細(xì)胞活率和密度，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)補(bǔ)料。
結(jié)論
使用CytoLinX® WB 一次性波浪式生物反應(yīng)器流加培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)生長趨勢與搖瓶對照組以及歷史批次趨勢基本一致，結(jié)果符合預(yù)期，成功從搖瓶培養(yǎng)放大到波浪式反應(yīng)器培養(yǎng)。
參考文獻(xiàn)
1. Abaandou L, Quan D, Shiloach J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes. Cells. 2021 Jul 2;10(7):1667.
2. Pulix M, Lukashchuk V, Smith DC, Dickson AJ. Molecular characterization of HEK293 cells as emerging versatile cell factories. Curr Opin Biotechnol. 2021 Oct;71:18-24.
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