質(zhì)粒是一類能在宿主細胞內(nèi)獨立于染色體外自主復制并穩(wěn)定遺傳的雙鏈超螺旋DNA分子，經(jīng)過改造后可以接入外源DNA作為基因載體，或者轉(zhuǎn)染細胞包裝病毒載體，以及作為DNA疫苗或者mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板等。不管是基因治療，核酸疫苗或者mRNA 模板，質(zhì)粒都按照較高的GMP生產(chǎn)標準進行工藝的設計與開發(fā)，并且系統(tǒng)性的優(yōu)化質(zhì)粒的上下游方案，以便獲得高產(chǎn)和高質(zhì)量的質(zhì)粒產(chǎn)品。
下圖展示了百林科可以提供的質(zhì)粒整體解決方案，包含上游的發(fā)酵培養(yǎng)以及下游的純化處理等工藝需求。本文將重點介紹微生物發(fā)酵過程中的關鍵影響因素以及優(yōu)化策略，百林科一次性生物反應器系列的設計與優(yōu)勢，典型的質(zhì)粒發(fā)酵應用案例。
圖1 百林科的質(zhì)粒整體解決方案
質(zhì)粒表達與發(fā)酵的關鍵因素
一般來講，決定質(zhì)粒的表達以及質(zhì)量水平通常跟菌株的選擇，質(zhì)粒載體的設計與構建以及培養(yǎng)基配方，補料策略以及發(fā)酵條件設計，發(fā)酵過程監(jiān)控以及放大策略等有較大關系。
01 發(fā)酵菌株的選擇：選擇適合質(zhì)粒表達的菌株是成功實現(xiàn)高效表達和大規(guī)模生產(chǎn)的關鍵。菌株的選擇應基于多個因素，包括目標基因的特性、菌株的生長速度、代謝特點、耐受性和表達能力等。目前大腸桿菌中Top 10 & DH5a 常用于質(zhì)粒的表達。
02 載體的設計與構建：根據(jù)目標基因的特性和表達需求，進行合理的質(zhì)粒載體設計。常見的質(zhì)粒載體包括原核表達載體和真核表達載體。
03 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化：發(fā)酵培養(yǎng)基配方不同對菌體生長和質(zhì)粒表達性能會有顯著影響。通過配方優(yōu)化，提供適當?shù)奶荚?、氮源、無機鹽和輔助因子等營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足菌體代謝需求和質(zhì)粒穩(wěn)定復制。
04 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：其中溫度、pH值、溶氧濃度和攪拌速度等參數(shù)會顯著影響發(fā)酵結果。這些條件的優(yōu)化需要結合菌株特性和質(zhì)粒表達要求，通過溫度的調(diào)整，可以實現(xiàn)較高的生長速度和表達效率。通過調(diào)整通氣量和攪拌速度來調(diào)整溶氧，以滿足菌體不同階段的代謝需求。
05 過程監(jiān)控與控制：建立全面的發(fā)酵過程監(jiān)測系統(tǒng)可以協(xié)助實現(xiàn)高效表達和穩(wěn)定產(chǎn)量。一般包括在線或離線監(jiān)測生物量、溶解氧濃度、pH值、營養(yǎng)物濃度以及產(chǎn)物積累等關鍵參數(shù)。通過對監(jiān)測數(shù)據(jù)的實時分析和控制策略的調(diào)整，可以優(yōu)化發(fā)酵過程的效率和穩(wěn)定性。
06 放大策略：放大過程中需要考慮發(fā)酵罐的尺寸選擇、通氣設備和攪拌系統(tǒng)的設計，以及相關的操作流程和控制策略。此外，放大過程中應注意擴散和傳質(zhì)問題，以保證質(zhì)粒表達的均一性和穩(wěn)定性。
綜上所述，要實現(xiàn)高效表達和大規(guī)模生產(chǎn)，需選擇適合的菌株和質(zhì)粒載體，優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，建立監(jiān)測與控制系統(tǒng)，并結合合理的放大策略。這些步驟需要深入研究、實驗驗證和優(yōu)化，并最終應用于工業(yè)化生產(chǎn)中。
百林科CytoLinX®BR 系列生物反應器
在質(zhì)粒發(fā)酵上的主要優(yōu)勢如下
1 高氧傳輸效率
BR生物反應器采用了先進的氣體傳輸技術和設計，可以提供優(yōu)異的氧氣溶解度和氣體液體傳質(zhì)性能，確保菌體在發(fā)酵過程中得到充足的氧氣供應。
2 優(yōu)化的溫度和pH控制
BR生物反應器配備了高精度的溫控和pH控制系統(tǒng)，能夠精確控制發(fā)酵過程中的溫度和pH值，提供理想的環(huán)境條件，以大程度地促進細菌生長和質(zhì)粒表達效率。
3 靈活的體積調(diào)節(jié)
BR生物反應器具有靈活的體積調(diào)節(jié)能力，可以適應不同規(guī)模的質(zhì)粒發(fā)酵需求。通過添加或移除可互換的工作容器單元，可以快速實現(xiàn)反應器體積的變化。這種可伸縮的設計使得BR生物反應器非常適合從實驗室中的小規(guī)模研究到工業(yè)化生產(chǎn)的大規(guī)模應用。
4 全自動化控制系統(tǒng)
BR生物反應器配備了全自動化控制系統(tǒng)，能夠?qū)崟r監(jiān)測和控制關鍵參數(shù)，如溫度、pH值、溶解氧濃度和攪拌速度等。通過這個系統(tǒng)，用戶可以對發(fā)酵過程進行精確的調(diào)節(jié)和優(yōu)化，提高質(zhì)粒表達的效率和穩(wěn)定性。
5 方便的操作和樣品采集
BR生物反應器的設計注重操作的便利性和樣品采集的方便性。人性化的用戶界面，提供直觀的操作指導和信息顯示。還提供了方便的樣品采集接口，使得用戶可以隨時獲取發(fā)酵樣品進行分析和評估。
綜上而言，百林科的CytoLinX® BR 生物反應器通過高氧傳輸效率、優(yōu)化的溫度和pH控制、靈活的體積調(diào)節(jié)、全自動化控制系統(tǒng)以及方便的操作和樣品采集，BR生物反應器能夠提供穩(wěn)定、高效的質(zhì)粒發(fā)酵環(huán)境，幫助實現(xiàn)質(zhì)粒表達的最佳結果。目前CytoLinX® BR MO微生物反應器最大可放大至50L。
圖2 百林科CytoLinX®BR生物反應器家族
圖3 百林科CytoLinX® BR生物反應器軟件特點
質(zhì)粒發(fā)酵的應用案例：
培養(yǎng)條件優(yōu)化與控制：使用CytoLinX®BR生物反應器進行小規(guī)模質(zhì)粒發(fā)酵試驗。通過對溫度、pH值、氧氣傳輸和攪拌速度等操作參數(shù)的優(yōu)化，提供了最適宜的環(huán)境條件以促進菌體生長和質(zhì)粒表達。通過全自動化的監(jiān)測和控制系統(tǒng)，實時跟蹤關鍵參數(shù)如溫度、pH值、溶解氧濃度和營養(yǎng)物濃度等。通過對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析和調(diào)整，及時控制發(fā)酵過程，以保證質(zhì)粒表達的效率和穩(wěn)定性。
優(yōu)化后的建議培養(yǎng)參數(shù)
? 溫度：37℃，變速補料(流速達到最大)開始后，調(diào)整溫度為35℃。
? 氧氣傳輸率(OTR)：攪拌速度：200-360rpm；通氣量：1.0-2.0vvm。
? pH值：定期監(jiān)測并調(diào)整，初期7.0，12h后調(diào)整為7.2。
? 補料策略：營養(yǎng)物流速(NFR)：依據(jù)比生長速率調(diào)整；加料時間點(Feed timing)：OD600>25開啟。
? 反饋控制：pH：7.0-7.2；DO：40%。
表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化與控制一覽表
圖4 CytoLinX®BR 生物反應器培養(yǎng)(E.Coli)過程
工藝放大：在小規(guī)模試驗成功后，研究人員將發(fā)酵條件和操作參數(shù)進行了相應的放大，通過增大工作容器單元的數(shù)量或調(diào)整反應器尺寸，實現(xiàn)了相應的發(fā)酵規(guī)模擴大。
圖5 CytoLinX®BR 50L生物反應器優(yōu)化后培養(yǎng)(E.Coli)過程
采用百林科的CytoLinX®BR生物反應器，該團隊成功實現(xiàn)了目標質(zhì)粒的高效表達條件優(yōu)化與生產(chǎn)放大。
圖 6 CytoLinX®BR生物反應器培養(yǎng)OD600展示
表2 工藝優(yōu)化后產(chǎn)量對比
這個案例再次證明了CytoLinX®BR生物反應器在質(zhì)粒發(fā)酵上的應用潛力，可提供高效的氧傳輸、優(yōu)化的溫度和pH控制、全自動化的監(jiān)測和控制系統(tǒng)等優(yōu)勢。
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