層析技術(shù)--作為生物制藥行業(yè)常用的分離純化手段，廣泛應(yīng)用于抗體、疫苗、基因與細(xì)胞治療、體外診斷等領(lǐng)域。其中，層析填料是層析技術(shù)的關(guān)鍵耗材。
根據(jù)前瞻產(chǎn)業(yè)研究院數(shù)據(jù)，2022 年全球?qū)游鎏盍鲜袌鲆?guī)模預(yù)計達(dá)到 63 億美元，其中生物制藥是層析填料最為重要的應(yīng)用領(lǐng)域[1]，隨著中國生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，層析填料的需求與日俱增，而其作為分離純化的關(guān)鍵耗材，占據(jù)了下游生產(chǎn)大部分成本。各醫(yī)藥企業(yè)基于法規(guī)和成本的雙重考慮：在不影響產(chǎn)品質(zhì)量及滿足產(chǎn)品收率的前提下，盡可能充分發(fā)揮填料的使用次數(shù)，延長填料的使用壽命，降低生產(chǎn)成本。
填料壽命研究開展的必要性
文獻(xiàn)研究表明：由于層析填料在其生命周期內(nèi)一直循環(huán)暴露于各種生物作用環(huán)境下，填料會發(fā)生一系列老化反應(yīng)，如圖1所示，包括配基問題(配基脫落、配基失活和配基閉塞)和柱床失效(基質(zhì)污染、基質(zhì)降解/變形)，進(jìn)而影響到其純化效果[2]。
圖1(A)典型大規(guī)模生產(chǎn)使用protein A填料示意圖(B)層析柱和填料被暴露于各種生物作用環(huán)境下(C)重復(fù)循環(huán)使用后填料老化示意圖
因此，確定層析填料的使用壽命是一個非常重要的問題，各國監(jiān)管部門也出于對藥品安全性和有效性的考量，在其法規(guī)文件有明確規(guī)定：《中國藥典》三部的“人用重組單克隆抗體制品總論”中提到需要驗(yàn)證純化用材料(如色譜柱填料)的重復(fù)使用性的可接受性限度[3]；FDA在1997年的“人用單克隆抗體產(chǎn)品的生產(chǎn)和分析考慮要點(diǎn)”中要求必須要有預(yù)先設(shè)定的使用限值[4]。
如何開展填料壽命驗(yàn)證？
PDA TR14[5]，柱層析工藝的驗(yàn)證中總結(jié)了層析填料所需要的研究/驗(yàn)證及規(guī)模要求。有些驗(yàn)證需要在商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模上進(jìn)行，而有些則只能在縮小模型上進(jìn)行(見表1)。
表1 不同規(guī)模的驗(yàn)證研究
關(guān)于層析填料壽命驗(yàn)證，大部分企業(yè)會在產(chǎn)品正式進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)之前，使用縮小模型開展填料的壽命研究，通過對柱效、載量、純度、雜質(zhì)含量、收率等評判維度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以確定填料的循環(huán)使用壽命。
縮小模型采用線性縮小的原則，維持層析純化的柱床高度、線性流速、上樣載量、緩沖液/柱體積比值(CV數(shù))以及洗脫收集標(biāo)準(zhǔn)不變，縮小層析柱的柱直徑、體積流速和樣品體積，同時關(guān)注層析柱壓力、樣品擴(kuò)散、系統(tǒng)死體積和柱效等因素。
層析填料壽命驗(yàn)證評估維度
? 評估柱效(HETP、As)
? 動態(tài)結(jié)合載量
? 色譜圖(峰高、峰寬、峰收集體積)
? 產(chǎn)品回收率、純度
? 雜質(zhì)殘留(DNA、HCP、Viruses、Endotoxin…)
良好的填料維護(hù)對層析填料的壽命至關(guān)重要，層析填料的維護(hù)主要包括再生、清潔和保存，需要同步開展驗(yàn)證。
層析填料的清潔驗(yàn)證
影響層析填料壽命的最重要因素是層析填料的再生和清潔。PDA TR14[5]指出：在進(jìn)行驗(yàn)證研究設(shè)計時就應(yīng)考慮填料的再生方法，以便建立填料重復(fù)使用限度。在工藝研發(fā)階段，就應(yīng)研發(fā)有效的填料清潔程序以允許介質(zhì)在多次生產(chǎn)批的重復(fù)使用并且提供充分的清潔。填料清潔程序的有效性將通過縮小規(guī)模前瞻性研究建立，然后在生產(chǎn)規(guī)模條件下，通過一個驗(yàn)證方案或者通過連續(xù)的監(jiān)測進(jìn)行確認(rèn)。填料的清潔程序應(yīng)有效，以阻止殘留物的積累。這將最小化對后續(xù)批的殘留，保持填料的性能。
層析填料的清潔驗(yàn)證可使用淋洗水方法或空白運(yùn)行方法。檢測的項(xiàng)目則包括TOC、總蛋白以及一些特定工藝相關(guān)雜質(zhì)，比如宿主細(xì)胞蛋白和宿主細(xì)胞核酸等?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)的話，一般采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不過企業(yè)也可以自行設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對于特定的工藝相關(guān)雜質(zhì)。
層析填料的保存驗(yàn)證
PDA TR60-3[6]生物制藥原液的工藝驗(yàn)證技術(shù)報告指出：應(yīng)證明在預(yù)期壽命內(nèi)保持層析填料性能特征所需要的保存時間和條件。盡管層析填料廠家可以提供填料的貨架期、保存液的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，但是仍然需要進(jìn)行一定的層析填料保存驗(yàn)證工作。主要是因?yàn)楣?yīng)商提供的層析填料保存數(shù)據(jù)是使用新鮮填料，并且在散裝保存條件下進(jìn)行。大多數(shù)生物制藥的實(shí)際生產(chǎn)中，保存的層析填料往往是使用過的，而且很多時候是柱上保存，因此層析填料的保存驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)考慮到這些實(shí)際條件，主要檢測項(xiàng)目包括微生物、內(nèi)毒素、功能等。
案例分享--百林科抗體親和填料MaXtar ARPA壽命驗(yàn)證
利用含有單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清，對MaXtar ARPA 親和層析介質(zhì)進(jìn)行了100個循環(huán)以上的測試，每個循環(huán)進(jìn)行0.5 M NaOH 15 分鐘的在位清洗，測試數(shù)據(jù)表明MaXtar ARPA親和層析介質(zhì)配基脫落水平較低，同時具有較高水平的動態(tài)結(jié)合載量(>70 mg/mL)，在進(jìn)行100個循環(huán)試驗(yàn)后依然可以達(dá)到80%初始水平。在146個試驗(yàn)循環(huán)內(nèi)，始終保持優(yōu)秀的HCP去除能力，同時樣品的SEC-HPLC表現(xiàn)出高純度和高穩(wěn)定性。
參考資料
1. 參考賽分招股書
2. Nweke MC, Rathore AS, Bracewell DG. Lifetime and Aging of Chromatography Resins during Biopharmaceutical Manufacture. Trend in Biotechnoly. 2018
3. US Food and Drug Administration (FDA). “Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use.” US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, February 1997
4. 2020 版《中國藥典》三部 “ 人用重組單克隆抗體制品總論 ”2.1.1工藝驗(yàn)證
5. PDA Technical Report No.14 Validation of Column-Based Chromatography Processes for the Purification of Proteins
6. PDA Technical Report NO 60-3: Process Validation: A Lifecycle Approach Annex 2: Biopharmaceutical Drug Substances Manufacturing
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