又是一年開學(xué)季，
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所謂結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，是指通過解析蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，深入理解蛋白質(zhì)在生命活動中的運(yùn)作原理，進(jìn)而為探尋疾病根源、以及設(shè)計(jì)新藥提供思路。而在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時，首先需要在載體構(gòu)建時克隆基因序列，并進(jìn)行外源性基因表達(dá)，再通過層析純化技術(shù)，把目的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的機(jī)體分離出來，分離出單一的蛋白質(zhì)樣品。
圖1：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)(網(wǎng)絡(luò)資料)
本文會從重組蛋白構(gòu)建中標(biāo)簽蛋白的選擇、不同外源表達(dá)策略以及重組蛋白層析純化三個方面進(jìn)行分享：
01
設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒時，可在其N端或C端引入親和標(biāo)簽方便后續(xù)純化，部分標(biāo)簽蛋白選擇特點(diǎn)如下表：
表1：標(biāo)簽蛋白的選擇
02 外源基因表達(dá)策略及其特點(diǎn)：
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大腸桿菌表達(dá)：
周期短，成本低，表達(dá)量高，培養(yǎng)簡單，標(biāo)簽多樣等優(yōu)勢。
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昆蟲細(xì)胞：
分泌表達(dá)， 周期長，表達(dá)量高，可同時表達(dá)多個基因。
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酵母細(xì)胞：
分泌表達(dá)，表達(dá)量高，純化工藝簡單。
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哺乳動物細(xì)胞：
在蛋白的起始信號、加工、分泌、糖基化方面具有優(yōu)勢，適合表達(dá)完整的大分子蛋白，表達(dá)產(chǎn)量不高。
03 重組蛋白之百林科層析填料選擇：
1 蛋白捕獲：標(biāo)簽蛋白親和層析填料選擇
親和層析是一種選擇性的純化方法，以兩個分子間高度特異性的生物相互作用為基礎(chǔ)，從復(fù)雜體系中捕獲目標(biāo)分子，因此選用親和層析來進(jìn)行純化時需要先對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)以及親和力位點(diǎn)進(jìn)行充分評估。His標(biāo)簽重組蛋白會在載體構(gòu)建階段引入組氨酸標(biāo)簽，因此可以選用含鎳離子的親和填料進(jìn)行捕獲，含有GST標(biāo)簽的重組蛋白可選用谷胱甘肽親和層析法。
圖2：百林科標(biāo)簽親和填料
2 蛋白精純之離子交換層析填料選擇
離子交換層析是一種依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)電荷差異而分離的純化方式，通常用在目標(biāo)產(chǎn)物精純階段。根據(jù)交換離子的不同可分為陰離子交換層析和陽離子交換層析。根據(jù)層析目的的不同，離子交換層析過程可選用兩種模式：(1)流穿模式：目標(biāo)產(chǎn)物與填料不結(jié)合，而盡量將雜質(zhì)結(jié)合在層析填料上；
(2)結(jié)合洗脫模式：目標(biāo)產(chǎn)物與填料結(jié)合，再使用一定濃度的鹽進(jìn)行洗脫。
圖3：百林科離子交換層析填料
除此之外，百林科能夠提供不同層析原理(包括凝膠過濾、疏水層析和多模式層析)多種填料的使用選擇，助力開展您的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)學(xué)研究。
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