隨著抗體類藥物被批準用于治療各種疾病，特別是在新冠疫情爆發(fā)之后，在過去十幾年的時間里，抗體已成為醫(yī)藥市場上暢銷的藥物種類之一。由于抗體藥物結構的特殊性和復雜性，導致了其質(zhì)量的不均一性，而抗體質(zhì)量屬性如糖型、聚體、蛋白表面電荷的變化，會顯著影響藥物的安全性和有效性。因此，我們需要在藥品制造過程中制定相應的控制策略，來得到目標的抗體質(zhì)量屬性。
細胞培養(yǎng)過程作為抗體藥物被細胞生產(chǎn)出來的階段，其培養(yǎng)環(huán)境的變化對于細胞的代謝和狀態(tài)均會產(chǎn)生很大的影響，從而影響抗體的質(zhì)量。因此，在細胞培養(yǎng)階段通過培養(yǎng)基篩選、小分子添加和工藝參數(shù)優(yōu)化等方式，來優(yōu)化抗體的質(zhì)量屬性來達到目標的安全性有效性，已經(jīng)成為工藝開發(fā)過程中最重要的步驟之一。
產(chǎn)品的關鍵質(zhì)量屬性(Critical Quality Attributes, CQAS),即對藥物的安全性和有效性有影響的質(zhì)量屬性，潛在的CQA主要包括片段化程度、聚體含量、電荷變體分布和糖基化構型等。它們與細胞胞內(nèi)的蛋白翻譯后修飾和細胞胞外的降解過程密切有關，其差異主要形成與藥物的整個研發(fā)和生產(chǎn)過程中的細胞培養(yǎng)階段。
培養(yǎng)過程中影響抗體質(zhì)量屬性的因素
通 氣
在哺乳動物細胞生物反應器中，通氣是一個關鍵組成部分，特別是在高細胞密度下操作時，因為需要向細胞提供足夠的氧氣，同時必須去除二氧化碳，以防止其在培養(yǎng)液中積累。這通常使用氣體鼓泡和頂空通氣的組合來實現(xiàn)。在大型容器中，氧氣通過使用氣體鼓泡分散在底部附近來提供。生物反應器中使用的氣體擴散器可以是多孔熔塊鼓泡(由陶瓷、聚四氟乙烯或不銹鋼制成)或鉆孔鼓泡 (DHS)。前者會產(chǎn)生較小的氣泡，從而增加界面表面積和氣體停留量，但也更容易引起泡沫，對 CO2 汽提效果不佳。因此，經(jīng)常遇到雙鼓泡設計。下表概述了常用的不同設計和通氣配置。在大多數(shù)情況下，O2和CO2按需通入，以控制溶氧水平和 pH 值，而空氣則不斷通入，有時還供應到頂部空間。
氧 氣
在哺乳動物細胞培養(yǎng)中，溶氧水平通常保持在空氣飽和度的 10% 到 80% 之間。過高的氧濃度會導致活性氧 (ROS) 的積累，這會導致線粒體呼吸鏈和細胞內(nèi)氧化還原的改變，最終導致細胞生長抑制和特異性生產(chǎn)力下降。另一方面，低氧條件也會誘導 ROS 積累。研究已顯示在 20% DO 下 10 天的長時間暴露會引起與在 0.5%–5% DO 下暴露 1-3 天后觀察到的相同的缺氧反應。缺氧條件也與攝氧量減少和乳酸產(chǎn)量增加有關。ROS 積累與大規(guī)模(5,000 L)條件下生產(chǎn)力的顯著下降相關，而在小規(guī)模(20 L)條件下沒有遇到這種問題。因此，在規(guī)模放大過程中必須仔細選擇 DO 設定點；在類似的 DO 水平(空氣飽和度%)下，與臺式生物反應器相比，大型容器中的實際氧氣濃度將顯著更高。盡管表面通氣減少了由氣泡引起的剪切應力，但它對整體氣體傳輸?shù)呢暙I在更大的范圍內(nèi)變得可以忽略不計。為了減少由氣泡在氣液界面破裂引起的剪切應力，將表面活性劑，如Pluronic F-68(或 Kolliphor® P188)，添加到細胞培養(yǎng)液中。1 g/L(和高達 5 g/L)范圍內(nèi)的Pluronic 濃度通常用于提供剪切保護。
氧氣傳質(zhì)系數(shù) (kLa) 用于衡量系統(tǒng)的氧氣傳輸能力。對于給定的生物反應器配置，根據(jù)以下公式，kLa主要與單位體積功率輸入 (P/V) 和表觀氣體速度 (vs) 相關，其中 K 是常數(shù)，指數(shù) α和 β 分別約為 0.4 和0.5
氣泡大小、混合速度、氣體流速、體積和生物反應器幾何形狀等工藝參數(shù)都會影響 kLa。各種培養(yǎng)基成分，包括鹽、消泡劑和表面活性劑，也已被證明會影響傳質(zhì)系數(shù)。特別是，消泡劑被發(fā)現(xiàn)可以顯著降低 kLa。Pluronic F-68 也會降低 kLa，但程度較小，而鹽的添加會增加氧傳質(zhì)系數(shù)。另一個影響 kLa 的因素是葉輪的數(shù)量。一般來說，類似幾何形狀的生物反應器規(guī)模的增加將導致 kLa 的增加，正如在傳統(tǒng)攪拌罐和一次性生物反應器中所指出的那樣。液體高度的增加導致更長的氣體停留時間，從而允許更有效的氣體轉(zhuǎn)移。
二氧化碳
在哺乳動物細胞培養(yǎng)中，溶解的二氧化碳 (PCO2) 水平通常保持在 4-10% 的CO2飽和度 (30-70 mmHg)。高濃度的溶解CO2 (150–200 mmHg) 會對多種哺乳動物細胞的細胞生長和生產(chǎn)力產(chǎn)生不利影響。在 CHO 細胞培養(yǎng)中，高 PCO2 水平可抑制細胞生長、細胞生產(chǎn)力并改變產(chǎn)品質(zhì)量。溶解在水中的CO2通過與水反應形成碳酸鹽，其分解成碳酸，而引起酸化。培養(yǎng)液的酸化導致需在 pH 值控制的培養(yǎng)中添加堿，從而導致滲透壓增加。與正常水平(260-320 mOsm/kg)相比，滲透壓升高(460-500 mOsm/kg)會降低活細胞密度和活性。這在補料分批培養(yǎng)中進一步加劇，在這種情況下，濃縮營養(yǎng)物的補液可導致滲透壓高達 540 mOsm/kg。盡管CO2可能對細胞培養(yǎng)性能產(chǎn)生不利影響，但它仍然是核酸代謝合成所必需的，因此其濃度不得過低。與正常 PCO2 水平(28-54 mmHg)相比，發(fā)現(xiàn)超低 PCO2 水平(12.5-24.5 mmHg)在細胞培養(yǎng) 6 天后會降低活細胞密度和細胞活性。
大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)面臨著以與消耗氧氣大致相同的摩爾速率去除細胞產(chǎn)生的二氧化碳的問題。在大型容器中，頂空通氣通常不足以去除二氧化碳。因此，必須調(diào)整鼓泡流速和攪拌速度，以確保有效的二氧化碳汽提。應該注意的是，據(jù)報道，二氧化碳汽提與大型生物反應器中的氣體傳質(zhì)系數(shù)無關。相反，由于相對于氣泡飽和時間較長的氣體停留時間，二氧化碳會在培養(yǎng)基中積累；氣泡在離開培養(yǎng)基之前變得二氧化碳飽和，使得傳質(zhì)不再限制二氧化碳汽提。
攪 拌
攪拌不僅有助于確保均勻的條件，而且在改善傳質(zhì)方面也起著重要作用，這對于向細胞提供氧氣和去除二氧化碳很重要。大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)中的攪拌通常由軸向泵送葉輪提供，例如象耳槳或Rushton槳。在大型生物反應器中，通常在罐的周圍使用擋板以引起湍流。如果沒有擋板，葉輪提供的循環(huán)能量不足以促進適當混合所需的湍流運動。沒有擋板也會導致中心渦流的形成，這可能導致頂部空間和培養(yǎng)液之間的不受控制的氣體轉(zhuǎn)移。另一種增加流動湍流的策略是偏心安裝葉輪軸。這主要用于擋板不方便應用的情況，例如一次性生物反應器。
攪拌與通過單位體積功率輸入 (P/V) 進行的通氣有關。單位體積功率輸入是一個重要的工程參數(shù)，通常用作規(guī)模放大的標準，以確保可比的培養(yǎng)同質(zhì)性。
對于生物反應器中的 哺乳細胞培養(yǎng)，通常調(diào)整攪拌速度以獲得 10–80 W/m3 范圍內(nèi)的 P/V。設置攪拌條件時必須考慮的另一個關鍵因素是葉輪葉尖速度。
在增加的空氣或氧氣噴射流速下，需要較低的攪拌速度以保持氣體傳質(zhì)系數(shù) (kLa) 恒定。這反過來又增加了混合時間，并可能在培養(yǎng)液中產(chǎn)生異質(zhì)性，包括由不同的局部氣體傳質(zhì)系數(shù)引起的顯著溶氧梯度的存在。更大的容器中混合時間明顯更長的事實可能會進一步加劇這種情況。例如，發(fā)現(xiàn)混合時間從臺式 3 L 生物反應器的約 10 秒增加到工業(yè)規(guī)模生物反應器的約 120 秒?；旌蠒r間的增加會導致 pH、溶氧、二氧化碳和營養(yǎng)物濃度梯度。這些梯度可能會產(chǎn)生關鍵影響，因為細胞可能會經(jīng)歷非最佳操作條件區(qū)域(所謂的微環(huán)境)，從而導致總體培養(yǎng)性能下降。特別是，已發(fā)現(xiàn)糖基化模式受到不同溶氧水平的影響。由于 pH 不均勻性，活細胞密度和產(chǎn)物滴度也受到負面影響。在生物反應器中，由于混合良好的區(qū)域和增加的靜水壓力，在靠近葉輪的底部發(fā)現(xiàn)了較高的氣體傳質(zhì)系數(shù)。
CytoLinX®BR一次性罐體式反應器
? 智能PID參數(shù)，精確且穩(wěn)定控制培養(yǎng)參數(shù)
? 設備配件均采用進口品牌，精度更高
? 底通設計，能夠靈活組合微泡、中泡、大泡設計，滿足客戶工藝需求，優(yōu)化培養(yǎng)工藝，更好的提高細胞密度，維持細胞活率。
CytoLinX®GB臺式玻璃反應器
?靈活性強，適配度高，更多選擇讓工藝開發(fā)和表征更加靈活；
?設備控制的穩(wěn)定性，溫度，pH，DO 的聯(lián)動效果好；
? 大泡，微泡均可選擇，滿足多種工藝需求；
百林科基于豐富的反應器產(chǎn)品類型及硬件解決方案，助力細胞培養(yǎng)工藝。
參考文獻：
1. L.Lemire, P.L.Pham, Y.Durocher, et al., Practical Considerations for the Scale-Up of Chinese Hamster Ovary (CHO) Cell Cultures. Cell Culture Engineering and Technology, 2021.
掃描二維碼，
百林科多款產(chǎn)品
均可試用！
Bio-Link
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務